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Biology

संचयन एवं तैयारी ड्रोसोफिला भ्रूण electrophysiological रिकॉर्डिंग और अन्य प्रक्रियाओं के लिए

doi: 10.3791/1347 Published: May 20, 2009

Summary

इस तकनीक immunohistochemistry या electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए ड्रोसोफिला भ्रूण neuromusculature उजागर. यह neuromuscular विकास में जल्दी घटनाओं का अध्ययन या म्यूटेंट है कि नहीं हैच कर सकते हैं इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रदर्शन के लिए उपयोगी है.

Abstract

ड्रोसोफिला दोनों भ्रूण के विकास और कार्यात्मक तंत्रिका विज्ञान के अध्ययन के लिए एक प्रमुख आनुवंशिक मॉडल है . परंपरागत रूप से, इन क्षेत्रों एक दूसरे से काफी अलग कर रहे हैं काफी हद तक स्वतंत्र इतिहास और वैज्ञानिक समुदाय के साथ. हालांकि, इन आमतौर पर असमान क्षेत्रों के बीच इंटरफेस विकासात्मक कार्यक्रमों कार्यात्मक बिजली के संकेत गुण और तंत्रिका सर्किट के गठन के अंतिम चरणों के दौरान कार्यात्मक रासायनिक synapses के भेदभाव के अधिग्रहण अंतर्निहित है. इस अंतरफलक को जांच के लिए एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है. ड्रोसोफिला में, कार्यात्मक विकास के इन चरणों <8 घंटे की एक embryogenesis के आखिरी तीसरे के दौरान (25 डिग्री सेल्सियस पर) अवधि के दौरान पाए जाते हैं . यह देर विकासात्मक अवधि लंबी जांच एक कठिन, अभेद्य epidermal छल्ली के बयान के कारण असभ्य माना जाता था. एक सफलता अग्रिम पानी polymerizing शल्य चिकित्सा गोंद के अनुप्रयोग है कि स्थानीय स्तर पर छल्ली के लिए लागू किया जा सकता है देर चरण भ्रूण की नियंत्रित विच्छेदन सक्षम था. एक पृष्ठीय अनुदैर्ध्य चीरा के साथ, भ्रूण फ्लैट रखी जा सकता है, प्रयोगात्मक जांच करने के लिए उदर तंत्रिका की हड्डी और शरीर दीवार मांसलता को उजागर. इस प्रणाली के भारी कर दिया गया है को अलग और आनुवंशिक म्यूटेंट कि भ्रूण synapse गठन ख़राब है, और इस प्रकार आणविक तंत्र विनिर्देश और synapse कनेक्शन और कार्यात्मक synaptic संकेत गुणों के भेदभाव को नियंत्रित प्रकट विशेषताएँ इस्तेमाल किया.

Protocol

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भाग 1: उपकरण और आपूर्ति

  1. एक अच्छा विच्छेदन खुर्दबीन भ्रूण dissections के लिए आवश्यक है, 40x बढ़ाई, 25x-आंख टुकड़ों के साथ सुझाव दिया है करने के लिए ज़्यादा से ज़्यादा बढ़ाई वृद्धि.
  2. ठीक संदंश (संख्या 5) भ्रूण और भ्रूण के devitellinization के मैनुअल चयन के लिए आवश्यक हैं.
  3. उपकरण बनाने के लिए और ठीक कांच सुइयों को संशोधित की आवश्यकता है. खींच ग्लास सुइयों विच्छेदन के लिए आवश्यक हैं. हम विच्छेदन (अब पिछले) के लिए ठोस कांच पसंद करते हैं, लेकिन मानक मोटी दीवारों ग्लास टयूबिंग (बाहरी व्यास 1-1.5 मिमी) के रूप में अच्छी तरह से काम करता है. कुछ लोगों को ठीक टंगस्टन सुइयों, 1M NaOH एक 10 + Amp autotransformer बैटरी का उपयोग कर के एक स्नान में वांछित तीखेपन के लिए electrolyzed उपयोग करें. बढ़ाई टंगस्टन विच्छेदन सुइयों लाभ है कि वे अपेक्षाकृत लचीला कर रहे हैं और लंबे समय से स्थायी है. खोखले गिलास सुई (दबाना इलेक्ट्रोड पैच इसी तरह का गठन) प्लास्टिक टयूबिंग से जुड़े होते हैं और चूषण और खारा के निष्कासन के लिए विच्छेदन रूप में अच्छी तरह के रूप में गोंद का नियंत्रित वितरण के दौरान इस्तेमाल किया. कांच खींचने की एक किस्म के कांच सुइयों के निर्माण के लिए उपलब्ध हैं. कम्प्यूटर क्रमादेशित खींचने आकृति और आकार के एक किस्म खींच करने के लिए पूर्व निर्धारित किया जा सकता है. ब्राउन ज्वलंत मॉडल (Sutter उपकरण कं) व्यापक रूप से अनुग्रह प्राप्त कर रहे हैं. एक यौगिक सूक्ष्मदर्शी (20-40x उद्देश्य) निरीक्षण और इलेक्ट्रोड को संशोधित करने से पहले उपयोग करने के लिए उपलब्ध होना चाहिए.
  4. समाधान के दो प्रकार सामान्यतः विच्छेदन के दौरान भ्रूण के ऊतकों के स्नान के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं: 1) "मानक" (जनवरी और जनवरी, 1976a) या संशोधित मानक "(Broadie 2000) salines, आमतौर पर अन्य invertebrate प्रणालियों में रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया समाधान पर आधारित है , और 2) "haemolymph की तरह" (hl) salines (स्टीवर्ट एट अल 1994), मानक खारा और ईओण ड्रोसोफिला haemolymph में मापा सांद्रता के बीच एक समझौता . यह नोट किया जाए कि इन salines में से कोई भी सही haemolymph के vivo में रासायनिक संरचना (Broadie 2000) की नकल करना चाहिए. मानक खारा होता है (मिमी): 135 NaCl, 5 KCl, 4 2 MgCl, 1.8 2 CaCl, 72 sucrose, 5 TES, 7.2 पीएच . प्रयोगकर्ता को भी व्यावसायिक तौर पर तैयार कीट (जैसे है Schneider कीट मीडिया) खारा है, जो electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए अनुपयुक्त है, लेकिन सबसे उजागर ऊतकों के स्वास्थ्य की रक्षा करने की संभावना है पर विचार करना चाहते हो सकता है.

भाग 2: भ्रूण मचान और विच्छेदन

  1. इष्टतम अंडे संग्रह के लिए, (<7 दिनों) युवा, स्वस्थ पुरुष और 2-3 दिनों के लिए ताजा बिछाने के बर्तन (20-40) पर महिला मक्खियों बनाए रखें. लेटो बर्तन आमतौर पर 100 मिलीलीटर (त्रिकोणीय डालो) प्लास्टिक beakers के लिए पर्याप्त हवा परिसंचरण, एक 60 मिमी अगर प्लेट को कवर प्रदान करने के लिए छिद्रित से मिलकर बनता है. अग्रवाल प्लेटें सेब या अंगूर का रस अगर साथ कठोर होते हैं. कई व्यंजनों मौजूद हैं, लेकिन एक उदाहरण निम्नानुसार है: पानी की 700 मिलीलीटर, 25-30 ग्राम अगर, रस ध्यान, (अंगूर या सेब) 0.5g मिथाइल paraben (पी hydroxymethylbenzoate) की 300 मिलीलीटर, और 30g चीनी है. पानी और अगर आटोक्लेव, और चीनी और रस के साथ अलग पी hydroxymethylbenzoate फोड़ा. अगर रस और समाधान का मिश्रण है और जल्दी 60 मिमी प्लेटों में डाल, बुलबुले हटाने.
  2. अंडे संग्रह करने से पहले, मक्खियों ताजा प्लेटों पर खमीर (4 ° C पर जमा पानी के 9 मिलीलीटर में 7 ग्राम बेकर की खमीर) चिपकाने के लिए, कम से कम दो दिनों के लिए कम से कम दो बार एक दिन में बदल के साथ खिलाया जाता है. 3 दिन तक, एक अच्छा बर्तन प्रति घंटे 100-200 अंडे का उत्पादन करना चाहिए. बेहतर अंडे बिछाने एक खरोंच थाली में अगर के साथ अपने पक्ष पर बनाए रखा पॉट पर मनाया जाता है. कई भ्रूण में रखा जाएगा या खरोंच करने के लिए अगले.
  3. भ्रूण की बड़ी संख्या को इकट्ठा करने के लिए, अगर थाली से धीरे एक तूलिका का प्रयोग टोकरी में भ्रूण हस्तांतरण. एक टोकरी में एक 15 या 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के साथ किया जा सकता है. पर्याप्त सतह क्षेत्र छोड़ने के लिए ढक्कन और ट्यूब के शीर्ष के बीच एक स्क्रीन जाल (70 सुक्ष्ममापी जाल) नीचे कट. DH 2 0 के साथ भ्रूण कुल्ला और ताजा 50% से 100% बाहरी chorion निकालने ब्लीच की एक पेट्री डिश में डाल दिया . वैकल्पिक रूप से, अंडे व्यक्तिगत एकत्र किया जा सकता है ठीक संदंश का उपयोग कर, और ब्लीच की एक बूंद में उन्हें मैन्युअल रूप से रखकर dechorionated. De-chorionation 30 सेकंड से 2 मिनट (ताजा ब्लीच बहुत तेजी से है) को ले सकते हैं, और विच्छेदन खुर्दबीन के तहत निगरानी की जानी चाहिए. Chorion का हटाया चमकदार, पारदर्शी vitelline झिल्ली को उजागर. Dechorionated अंडे जा संक्षेप में, rinsed चाहिए या खारा में रखा, के रूप में ब्लीच तेजी devitellinized ऊतकों को नष्ट कर.
  4. यह ध्यान से वांछित विकास उम्र के लिए भ्रूण चरण महत्वपूर्ण है. परिभाषित ड्रोसोफिला भ्रूण चरणों (1-17, Campos Ortega और Hartenstein, 1985) उपयोगी नहीं हैं, सभी कार्यात्मक neuromuscular विकास के रूप में देर से मंच के 16 या 17 चरण में होता है. इस प्रकार, भ्रूण विकास घंटे से 25 पर मंचन कर रहे हैं ° निषेचन या बाद घंटे में एक humidified इनक्यूबेटर में सी, और अधिक सामान्यतः, अंडे बिछाने (AEL) के बाद. इन शर्तों के तहत, embryogenesis 21 तक रहता है + / - 25 में 1 घंटे डिग्री सेल्सियस
  5. एक समय (अंडे रखना से अंडे 1-2 घंटा) कि उचित आयु वर्ग के हैं अगले रूपात्मक मापदंड के लिए देखा जाता है. DH 2 हे में व्यापक धोने के बाद, dechorionated अंडे एक प्लास्टिक पकवान संस्कृति (DH 2 हे के तहत) में देखने के लिए रखा जाता है. सही मचान रूपात्मक विच्छेदन माइक्रोस्कोप (Campos - Ortega और Hartenstein, 1985) के साथ परिलक्षित प्रकाश का उपयोग मापदंड के साथ पुष्टि की जा सकती है. सेने के कगार पर परिपक्व देर चरण भ्रूण (AEL 22-24 घंटों) आम तौर पर छल्ली और फुलाया ट्रेकिआ के विभाजन के द्वारा मान्यता प्राप्त हैं. भ्रूण भी GFP balancers और उपयुक्त फिल्टर के साथ एक प्रतिदीप्ति विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग genotyped किया जा सकता है.
  6. विच्छेदन के लिए, dechorionated और developmentally मंचन भ्रूण खारा की एक बूंद (1.5 कदम देखें) के तहत एक coverslip पर संलग्न (पृष्ठीय ऊपर की ओर) कर रहे हैं. भ्रूण vitelline झिल्ली से एक गिलास micropipette या टंगस्टन सुई के साथ पूर्वकाल या पीछे के अंत के पास झिल्ली puncturing, और फिर धीरे से झिल्ली से भ्रूण मुक्त द्वारा हटा रहे हैं. विच्छेदन के लिए तैयार करने में, भ्रूण पृष्ठीय सतह (ऊपर विच्छेदन वेंट्रल तंत्रिका तंत्र और प्रयोगों के लिए neuromusculature खुलासा होगा पृष्ठीय पक्ष coverslip पर तैनात किया जाना चाहिए हालांकि, भ्रूण जाहिर अन्य तरीकों से तैनात किया जा सकता है दूसरे के लिए उपयोग की सुविधा. ऊतकों).
  7. प्रारंभिक चरण भ्रूण (AEL <16 बजे) सीधे संलग्न करने के लिए गिलास या polylysine (पाली एल lysine hydrobromide, Broadie और पीटा, 1993a, ख) के साथ लेपित गिलास साफ है. वृध्द (AEL> 16 बजे) भ्रूण छल्ली गठन के बाद, आदर्श Sylgard लेपित coverslips (डॉव Corning), चिपके चाहिए. एक पानी polymerizing cyanoacrylate शल्य चिकित्सा या पशु चिकित्सा गोंद (Broadie और पीटा, 1993c, घ) प्रयोग किया जाता है. गोंद एक छोटे ग्लास इलेक्ट्रोड (10-20 सुक्ष्ममापी भीतरी व्यास टिप) विंदुक गोंद मुँह के दबाव से नियंत्रित प्रवाह के साथ एक रबर ट्यूब से जुड़ी के माध्यम से वितरित किया जाता है. देखभाल गोंद प्रसव के दौरान लिया जाना चाहिए, के रूप में गोंद खारा संपर्क पर जल्दी polymerizes. नोट भी है कि gluing खारा में नहीं है या कम द्विसंयोजक आयन सांद्रता के साथ प्रदर्शन नहीं हो सकता है, कर सकते हैं के रूप में गोंद द्विसंयोजक आयनों को polymerize करने की आवश्यकता है है. गोंद की छोटी मात्रा में पहली बार के लिए मजबूती से सिर और पूंछ संलग्न किया जाता है.
  8. एक बार भ्रूण के सिरों coverslip से चिपके रहे हैं, एक चीरा एक गिलास इलेक्ट्रोड या तीव्रता टंगस्टन सुई के साथ पृष्ठीय midline के साथ किया जाता है. यह आसान धीरे चीरा की लाइन पहले perforating अंतिम कट करने के द्वारा किया जाता है. चीरा के पक्ष तो अधिक गोंद के साथ कर रहे हैं coverslip करने के लिए संलग्न करने के लिए धीरे भ्रूण फ्लैट का प्रसार. पेट, वसा शरीर और, वैकल्पिक, ट्रेकिआ तो एक गिलास रबर टयूबिंग (Broadie और 1993a ग पीटा) से जुड़ी पिपेट का उपयोग कर चूषण द्वारा हटा रहे हैं सहित आंतरिक अंगों. भ्रूण अब coverslip फ्लैट संलग्न किया जाना चाहिए, उदर केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के साथ नीचे epidermis, परिधीय नसों, और दैहिक मांसलता प्रयोग के लिए अवगत कराया.

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Discussion

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भ्रूण की सटीक मचान कारण सिर्फ कई घंटे के समय के पाठ्यक्रम पर कार्यात्मक संपत्तियों का तेजी से परिपक्वता के लिए महत्वपूर्ण है. कई मुद्दों पर इस मचान जटिल. सबसे पहले, सबसे शोधकर्ताओं समय अंडे चरण भ्रूण करने के लिए देता का उपयोग करते हैं, लेकिन अंडे बिछाने समय काफी विभिन्न स्थितियों (Broadie एट अल 1992) में जानवर से जानवर के लिए भिन्न हो सकते हैं. विशेष रूप में, एक सीमित आहार पर महिलाओं के लिए लंबी अवधि के लिए पहले बिछाने निषेचित अंडे को बनाए रखने के होते हैं. यह इसलिए कम से कम 2 दिनों के लिए एक अमीर खमीर आहार पर पूर्व खिलाने के लिए अंडे (Broadie एट अल 1992) इकट्ठा करके "स्पष्ट" महिलाओं के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, पुराने महिलाओं को भी पहले बिछाने एक लंबी अवधि के लिए अंडे बरकरार रहती है. एक पुराने महिला नियमित केवल अंडे अपने अंडे सेने के लिए एक दो घंटे पहले करना हो सकता है. इसलिए यह सबसे लगातार बिछाने बार (Broadie एट अल 1992) के लिए युवा महिलाओं (<7 दिनों) का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. दूसरा, देर भ्रूण चरणों के दौरान, यह मुश्किल है रूपात्मक मापदंड द्वारा पूरी तरह भ्रूण चरण. हाल स्पष्ट मचान सुविधाओं तक पूरा कर रहे हैं <16 बजे (Campos - Ortega और Hartenstein, 1985) AEL, लेकिन सबसे कार्यात्मक विकास होता है> 16 बजे AEL. स्वर्गीय विकास की विशेषताएं (जैसे tracheal हवा भरने, छल्ली कमाना) कुछ कर रहे हैं और कम अस्थायी प्रतिबंधित हो जाते हैं. इन कारणों के लिए, हम एक मिश्रित दृष्टिकोण की सिफारिश: 1-2 से अंडे एकत्र घंटा समय पर देता है, अच्छी तरह से परिभाषित <अवधि में 30 मिनट के प्रारंभिक रूपात्मक घटनाओं (जैसे gastrulation, पृष्ठीय बंद, 3 हिस्सा पेट के लिए मंच; Campos - Ortega और Hartenstein, 1985) और फिर एक अच्छी तरह से नियंत्रित 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वांछित उम्र के लिए सेते हैं.

मैनुअल विच्छेदन और गोंद आवेदन एक खुर्दबीन है कि कुछ लोगों को शुरू में अधिकारी के तहत ठीक मोटर कौशल की आवश्यकता होती है. इन कौशल समय पर विकसित किया जाना चाहिए. प्रयोगकर्ता के लिए सफलता की एक उच्च आवृत्ति उम्मीद से पहले दैनिक समर्पित अभ्यास के कई सप्ताह की एक न्यूनतम करने के लिए तैयार होना चाहिए. सीएनएस और कुछ वेंट्रल neuromuscular जंक्शनों का सूक्ष्म परीक्षण के लिए उपयुक्त तैयारी को प्राप्त अपेक्षाकृत जल्दी होना चाहिए, जबकि स्वस्थ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए उपयुक्त तैयारी आम तौर पर और अधिक प्रयास की आवश्यकता होगी.

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Acknowledgments

KB NIH अनुदान GM54544 द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Embryo Collection Cages Genesee Scientific 59-100 (for 60 mm dish; other sizes available) Cages can also be home made using punctured tri-pour beakers, as shown in video
Sylgard 184 Dow Corning Available from various companies Surgical glue adheres better to sylgard-coated coverslips
Fine glass tubing, outer diameter 1.0-1.5 mm Various For pulling into fine glass needles for dissection and tubes for glue delivery
Plastic tubing, to attach to glass pipette for mouth suction and glue application Tygon Tubing inner diameter needs to match glass outer diameter.

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References

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Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures. J. Vis. Exp. (27), e1347, doi:10.3791/1347 (2009).More

Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures. J. Vis. Exp. (27), e1347, doi:10.3791/1347 (2009).

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