הכתמה של חלבונים עם ג'ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

Summary

פרוטוקול קצר מכתים חלבון עם Coomassie מבריק כחול (CBB) G-250 ב ג'לים polyacrylamide מתואר ללא שימוש בממיסים אורגניים או חומצה אצטית כמו הנהלים מכתים קלאסית עם CBB.

Abstract

בשנת קלאסית מכתים פרוטוקולים חלבון באמצעות Coomassie מבריק כחול (CBB), פתרונות עם תוכן גבוה של ממיסים אורגניים רעילים דליקים (אתנול או מתנול 2-Propanol) וחומצה אצטית משמשים קיבעון, מכתים ו destaining של חלבונים בג'ל SDS לאחר עמודים. כדי לזרז את ההליך, חימום הפתרון מכתים לתנור המיקרוגל לזמן קצר משמש לעתים קרובות. בדרך כלל גורמת התאדות של מתנול רעילים או מסוכנים, אתנול או 2-Propanol ועל ריח חזק של חומצה אצטית במעבדה אשר יש להימנע בשל שיקולי בטיחות. בפרוטוקול שפורסם במקור בשתי בקשות לפטנט על ידי א.מ. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), הרכב חלופה לפתרון מכתים מתואר בה שום אורגני ממס או חומצה משמש. CBB הוא מומס במים bidistilled (60-80mg ליטר CBB לכל G-250) ו - 35 מ"מ HCl הוא הוסיף כמתחם רק השני בפתרון מכתים. Staning CBB של הג'ל נעשה לאחר שטיפה SDS-PAGE וממצה של הג'ל במים bidistilled. על ידי חימום במהלך ג'ל רחצה ו מכתים שלבים, התהליך יכול להסתיים מהר ולא compunds רעילים או מסוכנים הם מתאדים. צביעה של החלבונים מתרחשת כבר בתוך דקה 1 אחרי חימום ג'ל מכתים פתרון והיא מפותחת אחרי 15-30 דקות עם רקע כחול מעט כי הוא destained לחלוטין על ידי שטיפה ממושכת של הג'ל מוכתמת במים bidistilled, מבלי להשפיע על חלבון מוכתם להקות.

Protocol

חלק 1: הכנת התמיסה מכתים CBB

1. 60-80 מ"ג CBB G-250 הם מומס 1 ליטר מים bidistilled על ידי ערבוב במשך 2-4 שעות. לבסוף, 3 מ"ל של HCl מרוכזת מתווסף הפתרון כחול כהה עם ערבוב עוד דקה ומאוחסנים בחושך לשימוש מאוחר יותר. הפתרון יכול להיות מאוחסן במשך שבועות עד מספר חודשים מבלי לאבד את יעילות מכתים שלה.
2. HCl מרוכז צריכים להיות מטופלים עם und הטיפול הרגיל המשמש מתחת למכסה המנוע קטר. הפתרון הסופי יהיה בסביבות ה-pH 2, ולכן יש להשתמש בכפפות וכל מגע עם העור יש להימנע.

חלק 2: SDS-PAGE

1. Aliquots הולמת של דגימות חלבון מעורבבים עם טעינת חיץ בריכוז הסופי של המאגר 1x הטעינה. אנו משתמשים למאגר העמסה עם 2x 125mm Tris/H3PO4 (pH 7.5 במהירות של 25 ° C), 2mm EDTA, SDS 4%, 200mm DTT, כחול bromophenol 0.02% ו 50% גליצרול. מאגרים נוספים טעינה עבור SDS-PAGE ניתן להשתמש גם כן.
2. דגימות חלבון מחוממים על 5 דקות לפני הטעינה. בינתיים, תא אלקטרופורזה בג'ל מוכן הריצה. אנו משתמשים NuPAGE precast 4-12% © Bis-טריס ג'לים (Invitrogen) ב SureLock XCell ® Mini-Cell (Invitrogen) עם חיץ-MES חיץ פועל אבל כל ג'ל אלקטרופורזה אחרים במערכת יכול לשמש היטב.
3. דגימות חלבון נטענים על ג'ל אלקטרופורזה ו לרוץ 50 דק 'ב 220V.

חלק 3: צביעה של הג'ל

1. קלטת ג'ל הוא ג'ל מפורקים הניח בתוך קופסה על הצעדים הבאים כביסה.
2. כ 100 מ"ל מים bidistilled מתווסף הג'ל ומחוממת במיקרוגל למשך 30 שניות. חימום צריך לעצור לפני רתיחה מתרחשת. הקופסה עם הג'ל מושם אז 3-5 דקות על שייקר. צעד זה חוזר על עצמו פעמיים שטיפה עם מים מתוקים.
3. מספיק פתרון CBB מכתים נוסף כדי לכסות את הג'ל בתיבה תיבת מחומם במיקרוגל למשך 10 שניות. ללא רתיחה. הקופסה עם הג'ל מושם אז בשביל לסיים את מכתים על שייקר. כבר לאחר דקה 1, להקות חלבון ניתן לצפות, אחרי 15-30 דקות. מכתים חזקה מספיק ברוב המקרים.
4. הפתרון הוא מכתים ניגרה ו 50-100 מ"ל מים bidistilled נוסף כדי לקדם destain רקע תכלת ג'ל על שייקר. המים יכולים להיות מוחלפים ע"י מים מתוקים להמשך destaining במידת הצורך.
5. הג'ל ניתן לסרוק, לצלם או מיובשים עבור אחסון לטווח ארוך

חלק 4: תוצאות נציג:

ראה איור. 1 עבור ג'ל מוכתם כראוי הנוהל המתואר.

ראה איור. 2 עבור ג'ל שלא נשטף מספיק זמן לפני מכתים ו SDS שיורית מעכב כתמים יעיל. שים לב כי נתיבי סמן (*) להכיל את אותה כמות של חלבונים סמן.

איור. 1: ג'ל נציג מוכתם לאחר טעינת דגימות של טיהור חלבון (*: סמן משקל מולקולרי).

איור. 2: ג'ל CBB מוכתם שלא נשטפו מספיק זמן לפני מכתים CBB. להקות חלבון להופיע חלש (לב * סמן נתיב מכיל את אותה כמות של חלבון כמו איור. 1).

Discussion

• השלבים כביסה הם קריטיים עבור מכתים יעיל של חלבונים. זמן כביסה מופחת מתחת 2 דקות או נפח מופחתת של מים (<50 מ"ל) עלולה לגרום חיוור להקות חלבון כחול, ככל הנראה בשל כמויות גדולות יותר של SDS שאריות הג'ל.
• אם החלבונים הם הולכים להיות מנותח על ידי ספקטרומטריית מסה, השלבים לחימום בתנור מיקרוגל יש דילג, זמן לרחצה של הג'ל המורחבת כ 10 דקות בכל שלב וזמן מכתים הוארך עד עוצמת הלהקה חזקה מספיק . חימום התוצאות ג'ל crosslinking של חלבונים מטריצת הג'ל ולכן זיהוי של חלבונים על ידי ספקטרומטריית מסה יכול להיות הקשו.
• במקום CBB G-250, ניתן להשתמש CBB R-250 לפי הפרוטוקול המקורי על ידי Wondrak. אנחנו לא השוו גם צד לצד צבעים כמו שיש לנו מלאי של CBB G-250 במעבדה שלנו היו תוצאות טובות עם צבע זה.
• המהירות של ההליך לבין השמטה של ​​ממיסים רעילים או מסוכנים בשלבים כביסה מכתים הם הגורמים החשובים ביותר ומשכנע לשימוש בפרוטוקול זה. הרגישות היא באותו טווח של קלאסית פרוטוקולים CBB מכתים מסחרי מכתים פתרונות CBB ולא הייתה הגורם המגביל את הניתוח שלנו SDS-PAGE בתחום הביטוי וטיהור של חלבונים רקומביננטי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coomassie Brilliant Blue G-250	AppliChem	A3480	any other CBB G-250 could be used as well
Concentrated HCl