Summary
Короткий протокол для белка окрашивание Кумасси бриллиантовый синий (CBB) G-250 в полиакриламидном геле описывается без использования органических растворителей или уксусной кислоты, как в классической процедуры окрашивания CBB.
Abstract
В классической белка окрашивания протоколы с использованием Кумасси бриллиантовый синий (CBB), растворы с высоким содержанием токсичных и горючих органических растворителей (метанол, этанол или 2-пропанол) и уксусную кислоту используют для фиксации, окраски и destaining белков в геле после SDS -PAGE. Чтобы ускорить процедуру, отопление окрашивание раствора в микроволновой печи в течение короткого времени часто используется. Это обычно приводит к испарению токсичных или опасных метанол, этанол или 2-пропанол и сильный запах уксусной кислоты в лаборатории, которых следует избегать из-за соображений безопасности. В протокол, который был опубликован в двух патентных заявок Е. М. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (В1)), альтернативный состав окрашивание раствора описывается, в которых не органическим растворителем или кислотой. CBB растворяют в бидистиллированной воде (60-80мг в CBB G-250 на литр) и 35 мМ HCl добавляется как только другие соединения в красящим раствором. Staning CBB геля осуществляется после SDS-PAGE и тщательное мытье геля в бидистиллированной воде. При нагревании гель во время стирки и окрашивания шаги, процесс может быть завершен быстрее и не токсичных или опасных compunds испаряются. Окрашивание белков происходит уже в течение 1 минуты после нагрева геля в красящим раствором и полностью разработаны через 15-30 мин с немного синего фона, обесцвечивают полностью длительное мытье окрашенных геля в бидистиллированной воде, без ущерба для окрашенных белков полосы.
Protocol
Часть 1: подготовка решения окрашивания CBB
- 60-80 мг CBB G-250 растворяют в 1 литре бидистиллированной воды при перемешивании в течение 2-4 часов. Наконец, 3 мл концентрированной соляной кислоты добавляется в темно-синий раствор при перемешивании в течение другой минуты и хранить в темном месте для дальнейшего использования. Решение может храниться в течение недели до нескольких месяцев, не теряя своей эффективности окрашивания.
- Концентрированная HCl должны быть обработаны с обычным унд ухода используется под вытяжкой. Окончательное решение будет около рН 2, так что перчатки должны использоваться и любой контакт с кожей следует избегать.
Часть 2: SDS-PAGE
- Соответствующие аликвоты белка образцы смешиваются с загрузкой буфер конечной концентрации 1x загрузки буфера. Мы используем 2x буфера загрузки с 125мм Tris/H3PO4 (рН 7,5 при 25 ° С), 2 мМ ЭДТА, 4% SDS, 200 мМ DTT, 0,02% бромфенолового синего и 50% глицерина. Другие буферы загрузки для SDS-PAGE может использоваться также.
- Белки образцы нагревали в течение около 5 минут перед загрузкой. Между тем, камеры гель-электрофореза готова к перспективе. Мы используем сборно 4-12% NuPAGE © Bis-Tris гели (Invitrogen) в XCell SureLock ® Mini-Cell (Invitrogen) с MES-буфера, как работает буфер но и любой другой гель и электрофорез система может использоваться также.
- Белки образцы загружаются на гель и электрофорез в течение 50 мин при 220.
Часть 3: Окрашивание геля
- Гель кассета разбирается и гель помещают в коробку для последующей промывки.
- Около 100 мл бидистиллированной воды добавляется в гель и нагревают в микроволновой печи в течение 30 секунд. Отопление должны быть остановлены до кипения происходит. Коробка с гель помещают на шейкере в течение 3-5 мин. и это промывки повторяется дважды с пресной водой.
- Достаточно окрашивания CBB раствор добавляют, чтобы покрыть гелем в ящик и ящик нагревании в микроволновой печи в течение 10 сек. не доводя до кипения. Коробка с гель помещают на шейкер для отделки окрашивания. Уже через 1 минуту, белок полосы можно наблюдать, через 15-30 мин. Окрашивание является достаточно сильным, в большинстве случаев.
- Красящим раствором сливают и 50-100 мл бидистиллированной воды добавляется в целях дальнейшего destain голубом фоне геля на шейкере. Воду можно заменить свежей воды для дальнейшего destaining если это необходимо.
- Гель можно сканировать, сфотографироваться или сушеные для длительного хранения
Часть 4: Представитель Результаты:
См. рис. 1 для окрашенных правильно гель после описанной процедуры.
См. рис. 2 для геля, которые не были вымыты достаточно долго, до окрашивания и остаточного SDS тормозит эффективное окрашивание. Обратите внимание, что маркер полосы (*) содержат одинаковое количество маркеров белков.
Рис. 1: представитель гель окрашивали после загрузки образцов очистки белков (*: маркер молекулярного веса).
Рис. 2: CBB окрашенный гель, который еще не были вымыты достаточно долго перед окрашиванием CBB. Белка полосы появляются слабые (заметим, что * маркер переулок содержит столько же белка, как на рис. 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
- Промывки имеют решающее значение для эффективного окрашивания белков. Сократить время стирки ниже 2 мин или уменьшается объем воды (<50 мл) может привести к голубой белковых полос, скорее всего, за счет повышения количества остаточного SDS в геле.
- Если белки будут проанализированы масс-спектрометрии, отопления шаги в микроволновой печи должна быть пропущена, то время для мытья гелем продлен до 10 минут в каждом шаге и окрашивание времени продлен до интенсивности полосы достаточно сильна . Отопление геля приводит к сшивке белков матрицы геля и, следовательно, выявление белков методом масс-спектрометрии может быть затруднено.
- Вместо того, чтобы CBB G-250 можно использовать CBB Р-250 в соответствии с первоначальным протоколом по Wondrak. Мы не сравнивали как красители рядом, как у нас был запас CBB G-250 в нашей лаборатории и получили хорошие результаты с этого красителя.
- Скорость и процедура пропуска токсичных или опасных растворителей в стирке и окрашивание шаги являются наиболее важными и убедительными факторами для использования этого протокола. Чувствительность в том же диапазоне классической окрашивания протоколы CBB и коммерческие решения окрашивания CBB и не был сдерживающим фактором для наших SDS-PAGE анализа в области выражения и очистки рекомбинантных белков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов. Описанная выше процедура была впервые опубликована в патентной заявке Е. М. Wondrak (см..).
Acknowledgments
Мы хотели бы выразить признательность технической помощи Инес Racké.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 | AppliChem | A3480 | any other CBB G-250 could be used as well |
| Concentrated HCl |
References
- Process for fast visualization of protein. US patent. Wondrak, E. M. , 6319720 (B1) (2001).
- Solution for fast visualization of protein. US patent. Wondrak, E. M. , 2001046709 (A1) (2001).
