La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

Summary

Un protocollo corto per la colorazione delle proteine ​​con Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in gel di poliacrilammide è descritto senza l'utilizzo di solventi organici o acido acetico come nelle procedure di colorazione classica con CBB.

Abstract

Nei protocolli classica colorazione delle proteine ​​con Coomassie Brilliant Blue (CBB), soluzioni con alto contenuto di solventi organici tossici e infiammabili (metanolo, etanolo o 2-propanolo) e acido acetico vengono utilizzati per la fissazione, colorazione e decolorazione delle proteine ​​in un gel dopo SDS -PAGE. Per accelerare la procedura, il riscaldamento della soluzione colorante nel forno a microonde per un breve periodo è usato frequentemente. Questo di solito provoca l'evaporazione di metanolo tossici o pericolosi, Etanolo o 2-propanolo e un forte odore di acido acetico in laboratorio, che dovrebbe essere evitato per motivi di sicurezza. In un protocollo originariamente pubblicato in due domande di brevetto da EM Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), una composizione alternativa della soluzione di colorazione è descritta in cui nessun solvente organico o acido è usato. La CBB è disciolto in acqua bidistillata (60-80mg di CBB G-250 per litro) e 35 mM HCl è aggiunto come l'unico altro composto nella soluzione colorante. Il staning CBB del gel è fatto dopo SDS-PAGE e completa il lavaggio del gel in acqua bidistillata. Riscaldando il gel durante il lavaggio e la colorazione fasi, il processo può essere completato più velocemente e senza compunds tossici o pericolosi stanno evaporando. La colorazione delle proteine ​​si verifica già entro 1 minuto dopo il riscaldamento il gel in soluzione colorante ed è completamente sviluppato dopo 15-30 minuti con uno sfondo blu che è leggermente decolorato completamente dal lavaggio prolungato del gel colorato in acqua bidistillata, senza alterare la proteina macchiata bande.

Protocol

Parte 1: Preparazione della soluzione colorante CBB

1. 60-80 mg di CBB G-250 sono sciolti in 1 litro di acqua bidistillata mescolando per 2-4 ore. Infine, 3 ml di HCl concentrato viene aggiunto alla soluzione blu scuro con mescolando per un altro minuto e conservati al buio per un uso successivo. La soluzione può essere conservata per settimane fino a diversi mesi senza perdere la sua efficienza colorazione.
2. HCl concentrato deve essere maneggiato con la massima cura al solito utilizzati sotto una cappa aspirante. La soluzione finale sarà di circa pH 2, per cui i guanti devono essere utilizzati e qualsiasi contatto con la pelle deve essere evitato.

Parte 2: SDS-PAGE

1. Aliquote appropriato di campioni di proteine ​​sono miscelati con il caricamento del buffer ad una concentrazione finale di 1x tampone di caricamento. Noi usiamo il caricamento del buffer 2x 125mm con Tris/H3PO4 (pH 7,5 a 25 ° C), 2mM EDTA, 4% SDS, 200mm DTT, 0,02% bromofenolo blu e il 50% glicerolo. Buffer di carico di altri per SDS-PAGE può essere utilizzato come bene.
2. Campioni di proteine ​​vengono riscaldate per circa 5 minuti prima di caricarla. Nel frattempo, la camera di elettroforesi su gel è pronto per la corsa. Noi usiamo NuPAGE prefabbricati 4-12% © Bis-Tris gel (Invitrogen) in un SureLock XCell ® Mini-Cell (Invitrogen) con MES-tampone come il tampone di corsa, ma qualsiasi altro gel elettroforesi e il sistema può essere utilizzato come bene.
3. Campioni di proteine ​​sono stati caricati sul gel elettroforesi e correre per 50 minuti a 220V.

Parte 3: colorazione del gel

1. La cassetta gel viene smontato e il gel messo in una scatola per le fasi successive di lavaggio.
2. Circa 100 ml di acqua bidistillata viene aggiunta al gel e riscaldato nel forno a microonde per 30 secondi. Riscaldamento deve essere interrotto prima della bollitura si verifica. La scatola con il gel viene posto su un agitatore per 3-5 min. e questa fase di lavaggio viene ripetuto due volte con acqua fresca.
3. Basta soluzione colorante CBB è aggiunto per coprire il gel nella casella e la casella riscaldato nel forno a microonde per 10 secondi. senza portare all'ebollizione. La scatola con il gel viene posto su un agitatore per la finitura della colorazione. Già dopo 1 minuto, bande proteiche possono essere osservati, dopo 15-30 min. la colorazione è abbastanza forte nella maggior parte dei casi.
4. La soluzione colorante è travasato e 50-100 ml di acqua bidistillata è aggiunto per Decolorare ulteriormente lo sfondo azzurro del gel in uno shaker. L'acqua può essere sostituita con acqua fresca per ulteriori decolorazione, se necessario.
5. Il gel può essere scansionati, fotografati o essiccato per conservazione a lungo termine

Parte 4: Risultati Rappresentante:

Vedi fig. 1 per un gel colorato correttamente seguendo la procedura descritta.

Vedi fig. 2 per un gel che non è stato lavato abbastanza a lungo prima di colorazione e colorazione residua SDS inibisce efficiente. Si noti che le corsie marcatore (*) contengono la stessa quantità di proteine ​​marker.

Fig. 1: il gel colorato Rappresentante dopo aver caricato i campioni di una purificazione di proteine ​​(*: marcatore di peso molecolare).

Fig. 2: CBB gel colorato che non è stato lavato abbastanza a lungo prima di colorazione CBB. Le bande di proteine ​​appaiono più deboli (si noti che la corsia * marcatore contiene la stessa quantità di proteine ​​come in fig. 1).

Discussion

• Le fasi di lavaggio sono fondamentali per la colorazione efficiente delle proteine. Una riduzione dei tempi di lavaggio di sotto di 2 minuti o ridotto volume di acqua (<50 ml) può risultare in bande proteiche blu pallido, molto probabilmente a causa di una maggiore quantità di residui di SDS nel gel.
• Se le proteine ​​stanno per essere analizzati mediante spettrometria di massa, le fasi di riscaldamento nel forno a microonde deve essere ignorata, il tempo per il lavaggio del gel estesa a circa 10 minuti in ogni passo e il tempo di colorazione prorogato fino alla intensità band è abbastanza forte . Riscaldamento i risultati gel in reticolazione delle proteine ​​alla matrice del gel e quindi il rilevamento delle proteine ​​mediante spettrometria di massa potrebbe essere ostacolato.
• Invece di CBB G-250, si può usare CBB R-250 secondo il protocollo originale Wondrak. Non abbiamo confrontato entrambi i lati coloranti a fianco, come abbiamo avuto uno stock di CBB G-250 nel nostro laboratorio e aveva buoni risultati con questo colorante.
• La velocità della procedura e l'omissione di solventi tossici o pericolosi nelle fasi di lavaggio e la colorazione sono i fattori più importanti e convincenti per l'utilizzo di questo protocollo. La sensibilità è nella stessa gamma di protocolli di colorazione classica CBB e commerciali soluzioni colorazione CBB e non è stato un fattore limitante per il nostro SDS-PAGE analisi nel campo di espressione e purificazione di proteine ​​ricombinanti.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coomassie Brilliant Blue G-250	AppliChem	A3480	any other CBB G-250 could be used as well
Concentrated HCl