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Summary
우리는 정화를 위해 세슘 염화물 밀도 기울기 원심 분리 다음 0.22 μm의 Sterivex 필터에 집중 planktonic의 바이오 매스에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 추출을위한 방법을 설명합니다.
Abstract
이 방법은 스토리지 / 용해 버퍼를 취급하고 -80 ° C에 보관되었습니다 0.22 μm의 Sterivex 필터에 집중 planktonic의 바이오 매스에서 높은 분자량의 게놈 DNA를 추출하고, 세슘 염화물 밀도 기울기를 사용하여이 DNA를 정화하는 데 사용됩니다. 프로토콜은 세포에서 DNA를 해방하고 RNA를 제거하는 방법은 두 한 시간 배양 단계를 시작합니다. 다음으로, 페놀 일련의 : 클로로포름 및 클로로포름 extractions는 단백질과 세포막의 구성 요소, 수성 DNA 추출물의 수집과 추출을 씻어하고 집중 여러 버퍼 교환 단계를 제거하기 위해 원심 분리 다음에 수행됩니다. 부품 다섯 세슘 염화물 농도 기울기를 통해 옵션 정화에 대해 설명합니다. 그것은 혼동을 피하기 및 프로토콜 시간을 줄이려고 한 번에 미만 15 샘플에서 작동하도록 권장합니다. 이 프로토콜에 필요한 총 시간은 추출되는 샘플 수에 따라 달라집니다. 10-15 샘플 및 적절한 원심 분리 장비를 사용할 수있는 가정의 경우이 모든 프로토콜 3 일이 소요됩니다. 당신은 프로세스의 초기에 온도로 설정 하이브 리다이 제이션 오븐을 가지고 있는지 확인하십시오.
Protocol
참고 :이 프로토콜에서 사용되는 모든 시약이 작동 주식을이 당신의 DNA 샘플 및 연구소 주식 오염의 교차 오염을 방지하는 것이 매우 중요 작은 실험실로 주식에서 aliquoted 있습니다. 또한, pipetting 때 교차 오염을 피하기 위해 모든 외에도 위해 피펫 팁을 변경할 수 있는지 확인하십시오.
부 원 : 세포 용해와 소화
- 얼음 이전에 집중 planktonic의 바이오 매스를 포함 Sterivex 필터를 해동하여이 절차를 시작합니다. 단순 보려면 여기를 우리는 개별 필터를 처리를 위해 절차를 설명합니다. 실제로, 우리는 한 번에 처리 16 또는 이하의 필터를 권장합니다.
- 필터가 해동되면 두 incubations의 첫 시작 : 하나는 세포를 lyse하고 단백질을 분해하는 RNA, 그리고 하나를 제거합니다. 첫 부화 들어, 필터 100 μl 라이 소 자임 (1000 μl TE 125 MG) 20 ML RNase (10 μg / ML)을 추가합니다. Parafilm와 필터를 봉인하고 37 하이브 리다이 제이션 오븐에 ° C 1 시간을 회전 둡니다.
- 다음 부화 들어, 필터 100 μl Proteinase의 K 100 μl 20% SDS를 추가합니다. 55 봉인 그것이 하이브 리다이 제이션 오븐에 1-2시간 더 회전 Parafilm를 사용 떠나, 이번 ° C.
- 5cc 주사기를 사용하여 15 ML 팔콘 튜브로 Sterivex 필터의 lysate를 전송합니다. 1 ML의 용해 버퍼와 필터를 씻어가 5cc 주사기를 사용하여 팔콘 튜브의 lysate에 액체 린스 추가할 수 있습니다. 이제 lysed하고 세포를 소화했는지, 당신은 그들의 DNA를 추출 준비가되어 있습니다.
두 번째 부분 : DNA 추출
- 다음 단계는 당신의 lysate에서 DNA를 추출하기 위해 페놀 - 클로로포름 방법을 사용하는 것입니다. 교차 오염을 피하기 위해 각각의 이외에 대한 피펫 팁을 변경해야하고, lysate 튜브에 Isoamyl의 알코올 (IAA) : 클로로포름 : 페놀의 동일한 음량을 (3ml 정도) 추가합니다. 잘 섞어 10 초 와동.
- 원심 분리기가 균형되어 있는지 확인하고, 5 분 2천5백g에서 튜브를 스핀. 아래에 샘플에서 페놀, 클로로포름 및 단백질을 포함하는 유기 층, 그리고 당신의 DNA, 물 구성되어 수성 층을, 및 기타 : 원심 분리하는 동안, 페놀 - 클로로포름 - lysate 혼합물은 두 레이어로 분리해야합니다 맨에 대한 자세한 친수성 분자.
- 새로운 15 ML 팔콘 튜브에 수성 레이어를 (당신의 DNA를 포함)의 전송. 피펫 팁 (항상 뒤에 수성 층의 작은 금액을 떠나)와 인터페이스를 만지지 않도록주의하십시오.
- 교차 오염을 피하기 위해 각각의 이외에 대한 피펫 팁을 변경해야하고, IAA :이 새로운 튜브하려면, 클로로포름의 동일한 볼륨 (약 3mL)를 추가합니다. 10 초 와동. 이 단계는 당신의 DNA 샘플에서 남아있는 페놀을 제거하는 데 도움이됩니다.
- 수성 층 분명히 때까지 5 분 또는 2천5백그램에서 스핀. 새로운 표시 팰컨 튜브에 수성 레이어를 전송하고 피펫 팁 (항상 뒤에 수성 층의 작은 금액을 떠나)와 인터페이스를 터치하지 않도록주의하고, pH를 8.0에서 TE 1 ML를 추가합니다. 이것은 수성 층은 DNA 추출물이 포함되어 있습니다.
부 세 : DNA 농도 및 세척
- 다음 단계는 15 ML Amicon 울트라 원심 분리기 튜브의 DNA 샘플을 세척하고 집중하는 것입니다. Amicon 튜브가 (여과액)를 통해 흐름을 잡으려고 특정 분자량 (retentate)과 튜브에 이상 분자를 유지하는 필터로 구성되어 있습니다. 이 경우 필터는 DNA (retentate)을 유지합니다. Amicon 울트라 튜브 필터 구획 단계 2.5에서 DNA 추출물을 전송합니다.
- 10 분 3,500g에 스핀. Amicon 필터에 보관 액체 미만의 1 ML이 있는지 확인하십시오. 더 retentate 남아 리필 TE와 필터와 다시 스핀 경우. 교차 오염을 피하기 위해 모든 TE 추가를위한 신선한 피펫 팁을 사용해야합니다.
- 다른 팰컨 튜브로 흐름을 통해, 또는 여과수를 제거하고 젤에서 최종 DNA 제품을 확인까지 (파트 포) 냉장고에 저장합니다.
- Amicon 필터 2 ML TE 버퍼를 추가하고 교차 오염을 피하기 위해 각각의 TE 추가를위한 신선한 피펫 팁을 사용해야하고, 6 분 3천5백g에 스핀. 풀 스텝 3.3 그걸로 여과물하고 냉장고에 저장합니다.
- 세 세척 (항상 신선한 피펫 팁을 사용해야하는)의 총 TE와 함께 DNA 번 더 씻어하고, (사람마다 단계 3.3 및 3.4 등) 여과물 각 시간을 절약. 마지막 세척 들어, 스핀 Amicon 필터에 retentate 유해 200-500 ML까지. 최종 볼륨을 기록하고 표시 1.5 ML Eppendorf 튜브에 (당신의 DNA를 포함) retentate를 전송합니다.
부 네 : DNA 품질의 결정
- DNA의 품질을 확인하고 젤 0.8 % 아가로 오스 겔 역에서 샘플을 실행하여 DNA의 농도를 추정하룻밤 1ml ethidium 브로마이드 (EtBr)로 ined. (사용하는 경우 매우주의 EtBr를 이것은 알려진 mutagen하고 의심 발암 물질입니다. 종종 장갑을 변경하고 실험실의 나머지 부분과 피부에 EtBr 전송을 방지해야합니다.)으로서 DNA 사다리 옆에있는 샘플을로드 크기와 강도 기준 (다음 단계 참조).
- 처음 몇 차선에서, 다양한 분자 무게와 농도의 밴드와 함께 사다리를로드합니다. 처음이자 마지막 차선에서 (바깥쪽 차선), 1킬로바이트의 50ng/μl 부하 10 μl + 또는 2log 사다리 : 우리는 다음의 로딩 패턴을 권장합니다. 2,3 및 4 차선, 부하 2 μl, 5 μl 및 50ng/μl λHindIII의 사다리 각각 10 μl,에. 마지막으로, 각 샘플에 대한 염료와 DNA 추출물의 차선 당 5 μl를로드합니다.
- 약 16시간 15 볼트 (우리가 야간 실행하는 것이 좋습니다)에서 겔을 실행합니다.
- 그 다음날, UV 젤 문서 시스템을 사용하여 겔을 사진에 담아보세요. 당신의 DNA와 농도의 분자량 범위를 확인하려면 사다리의 밴드에 대한 샘플 밴드를 비교할 수 있습니다. 양질의 DNA 높은 분자량을 (> 36킬로바이트) 있고, 전단 / 저하의 작은 증거를 보여줍니다. 그림 1을 참조하십시오.
부품 다섯 : 세슘 클로라이드 그라데이션 원심 분리
- DNA 품질이 좋고 수량이 충분있다면, 당신은 세슘 염화물 (CsCl) 기울기 원심 분리를 수행하여 DNA를 정화 진행할 수 있습니다. 이 정화 단계는 선택 사항이며 모든 다운 스트림 응용 프로그램 (예를 들어, 당신이 단순히 PCR 반응을 수행하려는 경우 반면에, 정화는 보통 필요 없습니다, 당신이 정화서는 fosmid 라이브러리를 생성하려는 경우)에 필요한되지 않습니다. 첫째, 각 시료에 대해 하나 원심 분리기 튜브 레이블.
- 각각의 원심 분리기 튜브하려면, CsCl, 게놈 DNA의 178 μl 160 MG를 추가합니다. 튜브에 CsCl와 DNA를 추가한 후, 튜브 위에 parafilm의 작은 조각을 배치하고 부드럽게 구성 요소를 혼합하기 위해 튜브에게 10-20 번 반전. pipetting으로 혼합하지 마십시오, 이는 DNA의 전단 원인이 될 수 있습니다. 다음,이 튜브 10 μg / μl EtBr 10 μl를 추가하고 같은 방식으로 그것을 섞는다. (사용하는 경우 매우주의 EtBr - 그것이 알려진 mutagen하고 의심 발암 물질입니다. 종종 장갑을 변경하고 실험실의 나머지 부분과 피부에 EtBr 전송을 방지해야합니다.)
- 모든 튜브의 무게는 튜브 사이에 체중 차이가 1 MG보다하는 이러한 원심 분리하기 전에 균형 있는지 확인합니다.
- 회전자를 사용 hemostat에 튜브를 삽입, 뚜껑을 닫고 초원 심 분리기 내부의 회전자를 놓습니다.
- 초원 심 분리기 도어를 닫습니다. 진공, 당신은 빨리 문 닫아으로 적용됩니다. 18 시간 동안 100,000 RPM 20 ° C.에서 하룻밤 실행
- 원심 분리가 완료되면, 튜브 랙에 hemostat과 장소를 사용하여 회전자에서 튜브를 꺼내.
- 푸른 빛의 transilluminator로 DNA를 시각화하거나 사용할 경우 어두운 방에서 긴 파장 UV 라이트를 사용합니다. DNA 밴드를 볼 수 황색 필터 안경을 착용하십시오. 그림 2를 참조하십시오.
- 살균 1cc 주사기와 바늘을 (26G 8분의 5)를 사용하여 DNA 밴드를 제거하고 1.5ml Eppendorf 튜브에 놓으십시오.
- 주사기의 죽은 공간에 갇혀있는 DNA의 대부분을 복구하기 위해, 100 μl TE와 주사기를 씻어 튜브에 씻어서 솔루션을 추가합니다. 교차 오염을 방지하기 위해 시료 100 μl TE 버퍼 하나의 튜브를 준비합니다.
- DNA의 EtBr을 제거하려면 부드럽게 튜브 10-20 시간, 1 분 10,000 rpm으로 원심 분리기 반전, 튜브에 물이 포화 butanol의 동일한 볼륨을 추가하고 상위 레이어를 폐기하십시오.
- 4 번 이상 - butanol의 색상은 3 투명 때까지 세척 반복합니다.
- 플레이스 4 ML Amicon 울트라 원심 분리기 튜브의 TE하고 위에서 DNA 솔루션을 추가합니다.
- DNA의 볼륨이 약 100-500 μl (약 6~7분)로 감소 때까지 상온에서 3,500g에서 원심과 흐름을 통해 폐기하십시오.
- Amicon 필터 2ml TE를 추가하고 교차 오염을 피하기 위해 각 이외에 신선한 피펫 팁을 사용해야하고, 6 분 3,500그램에서 원심 분리기. 두 번 반복합니다.
- 필요에 따라 추가 원심 분리에 의해 50-100 μl의 최종 볼륨에 집중하고 새로운 1.5 ML Eppendorf 튜브에 필터의 DNA 솔루션을 전송할 수 있습니다.
- Amicon 필터 40 μl TE를 추가하고 나머지 DNA를 씻어 두 필터 세포막을 따라 위아래로 피펫. 5.15에있는 튜브에이 솔루션을 추가합니다.
- 200 μl autoclaved 물을 추가 7 분 동안 10,000 rpm으로 centrifuging하여 Microcon 튜브 및 prewash Microcon에 Microcon YM - 30 필터 장치를 배치합니다.
- 추가로 DNA를 집중 5.16에서 위해 prewashed Microcon에 DNA 솔루션을 추가합니다. 삼분 - 1 5천~1만g에서 원심 분리기. 액체의 양을 확인필터 및 반복 원심 분리에 필터에 액체의 양은 약 50 μl로 감소 때까지.
- 새로운 Microcon 튜브에 거꾸로 필터 장치를 삽입하고 3 분 1,000그램에서 원심 분리기. 집중 솔루션의 이상적인 크기는 50-60 μl입니다.
- 측정 및 Nanodrop에 DNA의 농도를 기록하고 (260nm한다) 최고의 품질을 확인합니다.
- 마이너스 20 주식과 동결 일을위한 깨끗한 eppendorf 튜브에 DNA의 작은 나누어지는을 전송합니다. 마이너스 80에서 두 번째 깨끗한 eppendorf 및 동결에 DNA의 나머지 부분을 전송합니다.
대표 결과 :
이 프로토콜이 올바르게 완료되면, 당신은 1 그림과 유사한 DNA 품질의 결정 단계에서 4.4 후 젤 이미지를 볼 수 있습니다. 추출물의 실제 DNA 농도는 샘플의 소스에 따라 달라집니다. CsCl 기울기 원심 분리 단계에서 5.7 후, 파란 빛으로 조명 게놈 DNA 2 그림과 유사해야합니다.
그림 1. intercalating 에이전트 ethidium 브로마이드 (10 MG / ML) 물들일 아북극의 태평양 (중복)를, 네 개의 깊이에서 수집한 높은 분자량의 DNA의 0.8 % 아가로 오스 겔 전기 영동 이미지. 젤은 1X TBE 젤 실행 버퍼에 ~ 16hrs을위한 15V에서 실행되었다. 샘플 밴드는 기계적 전단 (싱글 밴드 또는 여러 밴드 반대로 얼룩을 보여줍니다)의 작은 증거를 보여주는 좋은 품질의 10m 추출물 일부 RNA가 (0.5-2.0 KB 범위에 얼룩 참조) 이월 유지하지만.
그림 2. CsCl 기울기 원심 분리 후 파란 광선에 의해 조명 게놈 DNA 밴드.
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Discussion
처리하는 방법에 많은 샘플 아르에 따라이 두 한 시간 동안 부화 단계 및 반복 세척과 원심 분리 단계로 인해 시간이 많이 소요되는 절차하실 수 있습니다. 충분한 시간을두고이 절차에 대한 이틀 동안 계획하는 것이 좋습니다. 해당 볼륨이 남은까지 (파트 3 번 반복) 추가 TE의 세척 및 centrifugations하고 시도, DNA 농도 및 세척하는 동안 200 500μl로 줄이기 위해 Amicon 튜브의 마지막 추출 볼륨을 받고 문제가있다면. 추출이 심하게 클로로포름의 냄새가있다면 또한, 그것은 냄새가 클로로포름의 모든이 제거되어 있는지 확인하기 위해 lessens까지 추가로 세척을하는 것이 좋습니다. 다시,이 프로토콜에 사용되는 모든 시약은 작은 작업에 실험실 주식 aliquoted 아르 주식 - 이것은 당신의 DNA 샘플 및 연구소 주식 오염의 교차 오염을 피하기 위해 매우 중요합니다. 또한, pipetting 때 교차 오염을 피하기 위해 모든 외에도 위해 피펫 팁을 변경할 수 있는지 확인하십시오.
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Acknowledgments
우리는 해안과 열린 바다 바닷물의 낮은 산소 지역에 지속적인 연구를 지원하기위한 혁신, 브리티시 컬럼비아 기술 개발 기금과 국립 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 (NSERC)에 대한 캐나다 재단 감사드립니다. JJW가 NSERC와 도스의 장학금이 지원되었고 NSERC, 킬람와 툴라 기초 미생물 다양성과 진화에 대한 재정 지원 센터에서 장학금으로 지원했다. SL은 미생물 다양성과 발전을위한 기초 자금 툴라 센터에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 cc syringe (26G5/8 needle) | BD Biosciences | 309597 | |
| 1 ml syringe (26G5/8 needle) | BD Biosciences | 309597 | |
| 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 15ml tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 5cc syringe | BD Biosciences | 309603 | |
| Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices | EMD Millipore | UFC801096 | 10,000 Nominal molecular weight limit |
| Butanol | Fisher Scientific | A383-1 | Make it water saturated (butanol:water = 1:1) |
| Centrifuge rotor, JA5.3 | Beckman Coulter Inc. | 368690 | |
| Centrifuge, Avanti® J-E | Beckman Coulter Inc. | 369003 | |
| Cesium chloride | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| Chloroform:IAA (24:1) | Sigma-Aldrich | 25666-500ML | |
| Ethidium Bromide (EtBr) | Sigma-Aldrich | E1510-10ml | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C |
| Lysis Buffer | 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3) | ||
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-5G | 125 mg in 1000 μl TE |
| Microcon® Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | 42410 | 50 bp cut off |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | |
| RNase A | Fisher Scientific | BP2539-100 | 10 μg/ml |
| Safe Imager™ Blue light transilluminator | Invitrogen | S37102 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L4509 | 20% SDS |
| Sterivex filters | Fisher Scientific | SVG010RS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| TE buffer, pH 8.0 | |||
| Trizma® base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Ultracentrifuge rotor, TLA 100 | Beckman Coulter Inc. | 343847 | |
| Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC) | Beckman Coulter Inc. | 343775 | |
| Ultracentrifuge tube rack | Beckman Coulter Inc. | 348302 | |
| Ultracentrifuge, Optima® Max | Beckman Coulter Inc. |
References
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).
- DeLong, E. F. Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Stein, J. L., Marsh, T. L. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).
- Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).
Tags
분자 생물학 제 31 미생물학 해수 DNA 추출 세슘 염화물 밀도 기울기 원심 분리 장치Erratum
Formal Correction: Erratum: DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014.
Citeable Link.
A correction was made to "DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 ml RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 μl RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
