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Summary
Wir beschreiben ein Verfahren zur Gewinnung von hohem Molekulargewicht von genomischer DNA aus planktonischen Biomasse auf 0,22 um Sterivex Filter, durch Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation zur Reinigung folgte konzentriert.
Abstract
Diese Methode wird verwendet, um hochmolekulare genomische DNA aus planktonischen Biomasse auf 0,22 &mgr; M Sterivex Filter, die mit Lagerung / Lysepuffer behandelt worden sind und archiviert werden bei -80 ° C konzentrierten Extrakt, und diese DNA mit einem Cäsiumchlorid-Dichtegradienten zu reinigen. Das Protokoll beginnt mit zwei einstündigen Inkubation Schritte, um DNA aus den Zellen zu befreien und zu entfernen RNA. Als nächstes wurde eine Reihe von Phenol: sind Chloroform und Chloroform-Extraktionen durch Zentrifugation durchgeführt, gefolgt von Proteinen und Zellmembran Komponenten, Sammlung der wässrigen DNA-Extrakt, und mehrere Puffer Austausch Schritte zu waschen und zu konzentrieren, den Extrakt zu entfernen. Fünfter Teil beschreibt die optionale Reinigung über Cäsiumchlorid-Dichtegradienten. Es wird empfohlen, mit weniger als 15 Proben auf einmal arbeiten, um Verwechslungen zu vermeiden und hieb-Protokoll Zeit. Die Gesamtzeit für dieses Protokoll benötigt wird, hängt von der Anzahl der Proben extrahiert werden. Für 10-15 Proben und unter der Annahme der richtigen Zentrifugation Ausrüstung zur Verfügung steht, sollte dieses gesamte Protokoll zu 3 Tage. Vergewissern Sie sich, die Hybridisierung Öfen gesetzt, um Temperatur zu Beginn des Prozesses.
Protocol
Hinweis: Alle Reagenzien dieses Protokoll verwendet werden vom Labor Aktien in kleinere Arbeitsgruppen Aktien-das ist sehr wichtig, um eine Kreuzkontamination der DNA-Proben und Kontamination von Labor-Bestände zu vermeiden aliquotiert. Auch beim Pipettieren, stellen Sie sicher, Pipettenspitzen für jede zusätzlich um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, ändern.
Part One: Cell Lysis und Verdauung
- Beginnen Sie dieses Protokoll durch Auftauen der Sterivex Filtern, die zuvor konzentriert planktonischen Biomasse enthalten auf dem Eis. Der Einfachheit halber hier beschreiben wir das Verfahren für die Verarbeitung eines einzelnen Filters. In der Praxis empfehlen wir die Verarbeitung von 16 oder weniger Filter auf einmal.
- Sobald der Filter hat aufgetaut, beginnt die erste von zwei Inkubationen: eine, um die Zellen zu lysieren und entfernen RNA, und einer zu brechen Proteine. Für die erste Inkubation mit 100 ul Lysozym (125 mg in 1000 ul TE) und 20 ml RNase A (10 pg / ml), um den Filter. Verschließen Sie die Filter mit Parafilm und lassen Sie es in der Hybridisierungsofen bei 37 ° zu drehen C für 1 Stunde.
- Für die nächsten Inkubation mit 100 ul Proteinase K und 100 ul 20% SDS, um den Filter. Reseal mit Parafilm und lassen Sie es 1-2 Stunden mehr in der Hybridisierungsofen drehen, diesmal bei 55 ° C.
- Mit einer Spritze 5ml, übertragen Sie die Lysat aus dem Sterivex Filter in einen 15 ml Falcon-Röhrchen. Spülen Sie den Filter mit 1 ml Lysepuffer und fügen Sie die Spülflüssigkeit zum Lysat in Ihrem Falcon-Röhrchen mit dem 5cc Spritze. Jetzt haben Sie aufgeschlossen und verdaut Ihre Zellen, sind Sie bereit, ihre DNA zu extrahieren.
Zweiter Teil: DNA-Extraktion
- Der nächste Schritt ist es, die Phenol-Chloroform-Methode verwenden, um die DNA aus dem Lysat zu extrahieren. Fügen Sie dem gleichen Volumen (ca. 3 ml) von Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (IAA) zum Lysat Rohr, achten Sie darauf, Pipettenspitzen für jedes zusätzlich zu ändern, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Vortex für 10 Sekunden, um gut zu mischen.
- Drehen Sie das Rohr bei 2500 g für 5 Minuten, so dass Sie sicher, dass die Zentrifuge ist ausgewogen. Während des Laufs sollten die Phenol-Chloroform-Lysat Gemisch in zwei Schichten zu trennen: eine organische Schicht, die das Phenol, Chloroform und Proteine aus Ihrer Probe, auf dem Boden, und eine wässrige Schicht, die aus Ihrer DNA, aus Wasser besteht, und andere mehr hydrophilen Molekülen, an der Spitze.
- Übertragen Sie die wässrige Schicht (mit Ihrer DNA) in ein neues 15 ml Falcon-Röhrchen. Achten Sie darauf, die Schnittstelle mit der Pipettenspitze (immer verlassen eine kleine Menge der wässrigen Schicht hinter) berühren.
- Um dieses neue Rohr, das gleiche Volumen (ca. 3 ml) von Chloroform: IAA, achten Sie darauf, Pipettenspitzen für jedes zusätzlich zu ändern, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Vortex für 10 Sekunden. Dieser Schritt hilft, um alle verbleibenden Phenol aus Ihrer DNA-Probe zu entfernen.
- Spin bei 2500 g für 5 Minuten oder bis wässrige Schicht ist klar. Transfer wässrige Schicht in eine neue, etikettiert Falcon-Röhrchen und 1 ml TE bei pH 8,0, darauf achten, daß die Schnittstelle mit der Pipettenspitze (immer verlassen eine kleine Menge der wässrigen Schicht hinter) berühren. Diese wässrige Schicht enthält Ihre DNA zu extrahieren.
Dritter Teil: DNA-Konzentration und Waschen
- Der nächste Schritt ist sich zu waschen und konzentrieren die DNA-Probe in einer 15 ml Amicon Ultra-Zentrifugenröhrchen. Die Amicon Rohre bestehen aus einem Filter, der Moleküle bleibt bei oder über einem bestimmten Molekulargewicht (Retentat) und eine Rohrleitung in den Flow-Through-catch (das Filtrat). In diesem Fall behält der Filter Ihre DNA (Retentat). Übertragen Sie Ihre DNA-Extrakt aus Schritt 2.5, um den Filter-Fach eines Amicon Ultra Tube.
- Spin bei 3500 g für 10 Minuten. Vergewissern Sie sich, es ist weniger als 1 ml Flüssigkeit in der Amicon Filter zurückgehalten. Wenn mehr Retentat bleibt, füllen Sie den Filter mit TE und wieder zu drehen. Achten Sie darauf, eine frische Pipettenspitze für jedes TE zusätzlich nutzen, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
- Entfernen Sie die Flow-Through-oder Filtrat, zum anderen Falcon-Röhrchen und speichern Sie sie im Kühlschrank bis Sie Ihr endgültiges DNA-Produkt auf einem Gel bestätigt haben (Teil IV).
- 2 ml TE-Puffer auf die Amicon-Filter und Spin bei 3500 g für 6 Minuten, so dass Sie sicher, dass eine frische Pipettenspitze für jedes TE zusätzlich nutzen, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Pool Filtrat mit diesem Schritt 3,3 und in den Kühlschrank zu speichern.
- Waschen Sie die DNA zweimal mit TE für insgesamt drei Waschungen (achten Sie darauf, immer eine frische Pipettenspitze) und speichern das Filtrat jedes Mal (nach Stufen 3,3 und 3,4). In den letzten waschen, schleudern, bis 200 bis 500 ml Retentat verbleibt in der Amicon-Filter. Notieren Sie sich die letzte Band und Übertragung der Retentat (mit Ihrer DNA), um ein markiertes 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
Vierter Teil: Bestimmung der DNA-Qualität
- Überprüfen Sie die DNA-Qualität und schätzen Sie die Konzentration der DNA, indem Sie Ihre Proben auf einem Gel 0,8% Agarosegel stainiert mit 1ml Ethidiumbromid (EtBr) über Nacht. (Seien Sie äußerst vorsichtig bei der Verwendung von EtBr-it ist ein bekanntes Mutagen und Verdacht, krebserzeugend zu. Stellen Sie sicher, Handschuhe zu oft ändern und vermeiden EtBr übertragen, um den Rest des Labors und die Haut.) Legen Sie die Proben neben DNA-Leitern, die als dienen Größe und Intensität Standards (siehe nächster Schritt).
- In den ersten paar Gassen, laden Leitern mit Bands verschiedener Molekulargewichte und Konzentrationen. Wir empfehlen die folgenden Be-Muster: in der ersten und letzten Bahnen (äußerste Fahrstreifen), Last 10 ul der 50ng/μl von 1kb + oder 2log Leiter. In den Spuren 2,3 und 4, Last 2 ul, 5 ul, und 10 ul jeweils von 50ng/μl λHindIII Leiter. Schließlich Last 5 ul pro Bahn von DNA-Extrakt mit Farbstoff für jede Probe.
- Führen Sie das Gel bei 15 Volt für etwa 16 Stunden (wir empfehlen Nacht läuft).
- Am nächsten Tag, fotografieren das Gel mit einer UV-Gel-Dokumentations-System. Zur Bestimmung der Molekulargewichtsbereich der DNA und ihrer Konzentration, vergleichen Sie die Probe Bands Bands der Leitern. Gute Qualität DNA wird mit hohem Molekulargewicht (> 36kb), und zeigen kaum Anzeichen für Scheren / Abbau. Siehe Abbildung 1.
Fünfter Teil: Cäsiumchlorid Gradienten Zentrifugation
- Wenn die DNA-Qualität ist gut und die Menge ausreichend ist, können Sie fortfahren, um die DNA von der Durchführung einer Cäsiumchlorid (CsCl)-Gradienten-Zentrifugation gereinigt. Beachten Sie, dass diese Reinigung Schritt ist optional und ist nicht notwendig für alle Downstream-Anwendungen (zum Beispiel, wenn Sie Fosmid Bibliotheken Sie reinigen zu generieren, während, wenn Sie einfach nur PCR-Reaktionen durchzuführen, Reinigung normalerweise nicht notwendig ist wollen). Beschriften Sie zuerst ein Zentrifugenröhrchen für jede Probe.
- Zu jedem Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 160 mg CsCl, 178 ul von genomischer DNA. Nach der Zugabe von CsCl und DNA, um das Rohr legen ein kleines Stück Parafilm auf dem Rohr und sanft das Röhrchen 1-20 mal, um die Komponenten zu mischen. Mischen Sie nicht durch Pipettieren, kann dazu führen, Scheren der DNA. Anschließend fügen Sie 10 ul 10 ug / ul EtBr um dieses Rohr und mischen Sie es in der gleichen Weise. (Seien Sie äußerst vorsichtig bei der Verwendung von EtBr-it ist ein bekanntes Mutagen und Verdacht, krebserzeugend zu. Stellen Sie sicher, Handschuhe zu oft ändern und vermeiden EtBr übertragen, um den Rest des Labors und die Haut.)
- Stellen Sie sicher, dass das Gewicht aller Rohre vor dem Zentrifugieren, so dass das Gewicht Unterschiede zwischen den Röhren von weniger als 1 mg sind ausgewogen.
- Die Röhrchen im Rotor mit hemostat, den Deckel schließen und Ort der Rotor im Inneren der Ultrazentrifuge.
- Schließen Sie die Tür Ultrazentrifuge. Vacuum wird, sobald Sie die Tür zu schließen angewendet werden. Run über Nacht bei 100.000 rpm für 18 Stunden und 20 ° C.
- Wenn Zentrifugation abgeschlossen ist, nehmen Sie die Rohre aus dem Rotor mit hemostat und auf ein Rohr Rack.
- Visualisieren Sie die DNA mit blauem Licht Transilluminator, oder wenn nicht verfügbar, verwenden Sie langwelligen UV-Licht, in einem dunklen Raum. Tragen Sie ein Paar gelbe Filtergläser der DNA-Bande zu sehen. Siehe Abbildung 2.
- Mit einem sterilen 1cc Spritze und Nadel (26G 08.05), zu entfernen DNA-Bande und legen Sie sie in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
- Um wieder die meisten der DNA in den toten Raum in der Spritze befindliche, spülen Spritze mit 100 ul TE und fügen Sie die abgespült Lösung für das Rohr. Bereiten Sie eine Tube mit 100 ul TE-Puffer pro Probe, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
- So entfernen Sie EtBr aus der DNA, das gleiche Volumen an Wasser-Butanol auf die Tube, drehen Sie die Röhren vorsichtig 1-20 mal, Zentrifuge bei 10000 rpm für 1 Minute und entsorgen Sie die obere Schicht.
- Wiederholen Sie die Wäsche, bis die Farbe von Butanol ist transparent, 3 bis 4 mal.
- Platz 4 ml TE in einer Amicon Ultra-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie die DNA-Lösung von oben.
- Zentrifugation bei 3500 g bei Raumtemperatur, bis die DNA Volumen ca. 100-500 ul (ca. 6-7 Minuten) reduziert wird, und entsorgen Sie die Flow-Through.
- Add 2ml TE zu Amicon-Filter und Zentrifuge bei 3500 g für 6 Minuten, so dass Sie sicher, dass eine frische Pipettenspitze für jedes zusätzlich nutzen, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Zweimal wiederholen.
- Konzentrieren Sie sich auf ein Endvolumen von 50-100 ul durch zusätzliche Zentrifugation wie nötig und übertragen Sie die DNA-Lösung auf dem Filter in ein neues 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
- Zugabe von 40 ul TE zum Amicon-Filter und Pipette auf und ab entlang der beiden Filtermembranen zu waschen alle verbleibenden DNA. Fügen Sie diese Lösung, um das Rohr in 5,15.
- Legen Sie eine Microcon YM-30-Filter-Einheit in eine Microcon Rohr und Vorwäsche der Microcon durch Zugabe von 200 ul autoklaviert Wasser und Zentrifugieren bei 10000 rpm für 7 Minuten.
- Fügen Sie die DNA-Lösung von 5.16 bis die vorgewaschen Microcon um weiter zu konzentrieren die DNA. Zentrifuge bei 5000-10000 g für 1 bis 3 Minuten. Überprüfen Sie die Menge der Flüssigkeitauf dem Filter und wiederholen Zentrifugation bis die Menge der Flüssigkeit auf dem Filter wird auf etwa 50 ul reduziert.
- Platzieren Sie die Filtereinheit kopfüber in eine neue Microcon Rohr und Zentrifuge bei 1000 g für 3 Minuten. Die optimale Menge der konzentrierten Lösung beträgt 50-60 ul.
- Messen und notieren die Konzentration der DNA auf einem Nanodrop und überprüfen peak Qualität (sollte 260nm werden).
- Übertragen einer kleinen Teilmenge der DNA, um eine saubere Eppendorf-Röhrchen für die Arbeit Lager und frieren bei minus 20. Den Rest der DNA zu einem zweiten sauberen eppendorf und frieren bei minus 80.
Repräsentative Ergebnisse:
Wenn dieses Protokoll korrekt ausgeführt wird, sollten Sie ein Gelbild nach Schritt 4.4 in Bestimmung der DNA-Qualität ähnlich zu Abbildung 1 zu sehen. Actual DNA-Konzentration von Extrakten wird je nach Quelle der Probe. Nach dem Schritt 5.7 in CsCl-Gradienten-Zentrifugation sollte genomische DNA von blauem Licht beleuchtet ähnlich Abbildung 2.
Abbildung 1. 0,8% Agarosegelelektrophorese Bild von hochmolekularer DNA aus vier Tiefen in der subarktischen Pazifik (in zweifacher Ausfertigung), mit dem interkalierende Mittel Ethidiumbromid (10 mg / ml) angefärbt gesammelt. Gel wurde auf 15V für ~ 16 Stunden in 1X TBE-Gel-Laufpuffer laufen. Beispiel Bands sind von guter Qualität zeigen kaum Anzeichen für mechanische Scherung (zeigt einzelne Banden oder Schlieren auf mehrere Bänder Gegensatz), obwohl der 10m-Extrakte halten einige RNA übertragen (siehe Abstrich in der 0,5 bis 2,0 Kb-Bereich).
Abbildung 2. Genomic DNA-Bande durch blaues Licht nach CsCl-Gradienten-Zentrifugation beleuchtet.
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Discussion
Je nachdem, wie viele Proben verarbeitet werden sollen, kann dies eine zeitintensive Prozedur aufgrund der zwei einstündigen Inkubation Schritte, und die wiederholten Waschungen und Zentrifugationsschritte werden. Am besten ist es, zwei ganze Tage für dieses Verfahren zu planen, um genügend Zeit zu lassen. Wenn es Probleme gibt immer die endgültige Extrakt Volumen in der Amicon Rohr zu reduzieren bis zu 200-500μl während der DNA-Konzentration und Waschen, versuchen Sie zusätzliche TE Waschungen und Zentrifugationen (Wiederholung im dritten Teil), bis das entsprechende Volumen ist übrig. Auch, wenn der Extrakt riecht akut von Chloroform, ist es am besten, um zusätzliche Wäschen tun, bis der Geruch vermindert um sicherzustellen, dass alle das Chloroform entfernt wird. Auch hier sind alle Reagenzien im Sinne dieses Protokolls vom Labor Aktien in kleinere Arbeitsgruppen aliquotiert Aktien-das ist sehr wichtig, um eine Kreuzkontamination der DNA-Proben und Kontamination von Labor-Bestände zu vermeiden. Auch beim Pipettieren, stellen Sie sicher, Pipettenspitzen für jede zusätzlich um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, ändern.
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Acknowledgments
Wir möchten den kanadischen Stiftung für Innovation, der British Columbia Knowledge Development Fund und der National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada für die Unterstützung laufender Studien auf niedrigem Sauerstoffgehalt Regionen der Küsten-und offenen Meer zu danken. JJW wurde durch Stipendien von NSERC und DAW unterstützt durch Stipendien von NSERC, Killam und die TULA Stiftung finanziert Zentrum für Mikrobielle Diversität und Evolution unterstützt. SL wurde von der Stiftung finanziert TULA Zentrum für Mikrobielle Diversität und Evolution unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 cc syringe (26G5/8 needle) | BD Biosciences | 309597 | |
| 1 ml syringe (26G5/8 needle) | BD Biosciences | 309597 | |
| 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 15ml tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 5cc syringe | BD Biosciences | 309603 | |
| Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices | EMD Millipore | UFC801096 | 10,000 Nominal molecular weight limit |
| Butanol | Fisher Scientific | A383-1 | Make it water saturated (butanol:water = 1:1) |
| Centrifuge rotor, JA5.3 | Beckman Coulter Inc. | 368690 | |
| Centrifuge, Avanti® J-E | Beckman Coulter Inc. | 369003 | |
| Cesium chloride | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| Chloroform:IAA (24:1) | Sigma-Aldrich | 25666-500ML | |
| Ethidium Bromide (EtBr) | Sigma-Aldrich | E1510-10ml | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C |
| Lysis Buffer | 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3) | ||
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-5G | 125 mg in 1000 μl TE |
| Microcon® Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | 42410 | 50 bp cut off |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | |
| RNase A | Fisher Scientific | BP2539-100 | 10 μg/ml |
| Safe Imager™ Blue light transilluminator | Invitrogen | S37102 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L4509 | 20% SDS |
| Sterivex filters | Fisher Scientific | SVG010RS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| TE buffer, pH 8.0 | |||
| Trizma® base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Ultracentrifuge rotor, TLA 100 | Beckman Coulter Inc. | 343847 | |
| Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC) | Beckman Coulter Inc. | 343775 | |
| Ultracentrifuge tube rack | Beckman Coulter Inc. | 348302 | |
| Ultracentrifuge, Optima® Max | Beckman Coulter Inc. |
References
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).
- DeLong, E. F. Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Stein, J. L., Marsh, T. L. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).
- Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).
Tags
Molecular Biology Ausgabe 31 Mikrobiologie Meerwasser DNA-Extraktion Cäsiumchlorid-DichtegradientenzentrifugationErratum
Formal Correction: Erratum: DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014.
Citeable Link.
A correction was made to "DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 ml RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 μl RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
