Extraction de l'ADN à partir de 0,22 Filtres Sterivex uM et le césium Centrifugation gradient de chlorure de densité

Summary

Nous décrivons une méthode pour l'extraction d'ADN de haut poids moléculaire, génomique de la biomasse planctonique concentrés sur des filtres de 0,22 um Sterivex, suivie d'une centrifugation en gradient de chlorure de césium de densité pour la purification.

Abstract

Cette méthode est utilisée pour extraire l'ADN de haute moléculaire génomique du poids de la biomasse planctonique concentrés sur des filtres de 0,22 uM Sterivex qui ont été traités avec de stockage / tampon de lyse et archivée à -80 ° C, et à purifier cet ADN en utilisant un gradient de densité de chlorure de césium. Le protocole débute par deux étapes d'incubation d'une heure pour libérer l'ADN de cellules et de supprimer l'ARN. Ensuite, une série de phénol: chloroforme chloroforme et extractions sont effectuées suivie par une centrifugation pour éliminer les protéines et les composants de la membrane cellulaire, la collecte de l'ADN extrait aqueux, et plusieurs étapes d'échange de tampon à laver et à concentrer l'extrait. Cinquième partie décrit la purification en option via gradient de chlorure de césium de densité. Il est recommandé de travailler avec moins de 15 échantillons en une seule fois pour éviter la confusion et de réduire le temps de protocole. Le temps total requis pour ce protocole dépend du nombre d'échantillons à extraire. Pour 10-15 échantillons et en supposant que l'équipement de centrifugation adéquate est disponible, ce protocole devrait prendre toute les 3 jours. Assurez vous d'avoir les fours hybridation réglé à la température au début du processus.

Protocol

Remarque: Tous les réactifs utilisés dans le présent protocole sont aliquotées des stocks de laboratoire travaillant en petits stocks-ce qui est très important d'éviter la contamination croisée de vos échantillons d'ADN et la contamination des stocks de laboratoire. Aussi, lors du pipetage, assurez-vous de changer d'embout de pipette pour chaque ajout afin d'éviter la contamination croisée.

Première partie: la lyse cellulaire et la digestion

1. Commencez ce protocole par la fonte des filtres Sterivex qui contiennent de la biomasse planctonique préalablement concentré sur la glace. Pour plus de simplicité, ici, nous décrire la procédure de traitement d'un filtre individuel. En pratique, nous recommandons le traitement de 16 ou moins de filtres à la fois.
2. Une fois le filtre a dégelé, commence la première des deux incubations: un pour lyser les cellules et de supprimer l'ARN, et une pour décomposer les protéines. Pour la première incubation, ajouter 100 ul de lysozyme (125 mg en 1000 ul de TE) et 20 ml de RNase A (10 ug / ml) pour le filtre. Refermer le filtre avec du parafilm et laissez-le tourner dans le four d'hybridation à 37 ° C pendant 1 heure.
3. Pour l'incubation suivante, ajouter 100 à la protéinase K et 100 ul ul SDS 20% sur le filtre. Refermer avec Parafilm et laissez-le faire tourner une à deux heures de plus dans le four à hybridation, cette fois à 55 ° C.
4. En utilisant une seringue 5cc, le transfert du lysat du filtre Sterivex dans un tube Falcon de 15 ml. Rincer le filtre avec un tampon de lyse 1 ml et ajouter le liquide de rinçage au lysat dans votre tube Falcon en utilisant la seringue 5cc. Maintenant que vous avez lysées et digéré vos cellules, vous êtes prêt à extraire leur ADN.

Deuxième partie: Extraction de l'ADN

1. L'étape suivante consiste à utiliser la méthode au phénol-chloroforme pour extraire l'ADN à partir de votre lysat. Ajouter un volume égal (environ 3ml) de phénol: chloroforme: alcool isoamylique (IAA) au tube de lysat, en s'assurant de changer d'embout de pipette pour chaque addition pour éviter la contamination croisée. Vortex pendant 10 secondes pour bien mélanger.
2. Spin le tube à 2500 g pendant 5 minutes, en veillant à la centrifugeuse est équilibré. Pendant la centrifugation, le mélange phénol-chloroforme-lysat devrait se séparer en deux couches: une couche organique contenant du phénol, du chloroforme, et des protéines à partir de votre échantillon, sur le fond, et une couche aqueuse, qui se compose de votre ADN, de l'eau, et d'autres molécules plus hydrophiles, sur le dessus.
3. Transférer la phase aqueuse (contenant votre ADN) dans un nouveau tube Falcon de 15 ml. Soyez prudent de ne pas toucher à l'interface avec la pointe de la pipette (toujours laisser une petite quantité de la couche aqueuse derrière).
4. Pour ce nouveau tube, ajouter un volume égal (environ 3 ml) de chloroforme: IAA, en s'assurant de changer d'embout de pipette pour chaque addition pour éviter la contamination croisée. Vortex pendant 10 secondes. Cette étape permet de retirer tout le phénol restant de votre échantillon d'ADN.
5. Centrifuger à 2500 g pendant 5 minutes ou jusqu'à ce que la couche aqueuse est claire. Transfert couche aqueuse dans un nouveau tube Falcon étiquetés et ajouter 1 ml de TE à pH 8,0, en faisant attention à ne pas toucher à l'interface avec la pointe de la pipette (toujours laisser une petite quantité de la couche aqueuse derrière). Cette couche aqueuse contenant vos extraire l'ADN.

Troisième partie: Concentration d'ADN et de lavage

1. La prochaine étape est de se laver et de se concentrer l'échantillon d'ADN dans un tube de 15 ml Amicon Ultra centrifugeuse. Les tubes Amicon se composent d'un filtre qui retient les molécules au niveau ou au dessus d'un poids spécifié moléculaire (rétentat) et un tube pour attraper le flux continu (le filtrat). Dans ce cas, le filtre retient votre ADN (le rétentat). Transférez vos extraire l'ADN de l'étape de 2,5 à le compartiment du filtre d'un tube de Amicon Ultra.
2. Centrifuger à 3500 g pendant 10 minutes. Assurez-vous qu'il ya moins de 1 ml de liquide retenu dans le filtre Amicon. S'il reste plus d'rétentat, remplir le filtre avec TE et de spin à nouveau. Assurez-vous d'utiliser une pointe de pipette propre pour chaque ajout TE afin d'éviter la contamination croisée.
3. Retirez le flux continu, ou filtrat, à un autre tube Falcon et l'enregistrer dans le réfrigérateur jusqu'à ce que vous avez confirmé votre produit d'ADN sur un gel de finale (quatrième partie).
4. Ajouter 2 ml de tampon TE au filtre Amicon et centrifuger à 3500 g pendant 6 minutes, en veillant à utiliser une pointe de pipette propre pour chaque ajout TE afin d'éviter la contamination croisée. Piscine filtrat avec celle de l'étape 3.3 et enregistrez-le dans le réfrigérateur.
5. Laver l'ADN deux fois plus avec TE pour un total de trois lavages (en veillant à toujours utiliser un embout de pipette frais), et en enregistrant le filtrat à chaque fois (comme des étapes 3.3 et 3.4). Pour le dernier lavage, rotation jusqu'à 200 à 500 ml de rétentat reste dans le filtre Amicon. Noter le volume final et le transfert du rétentat (contenant votre ADN) à un tube étiqueté Eppendorf de 1,5 ml.

Quatrième partie: Détermination de la qualité de l'ADN

1. Vérifiez la qualité de l'ADN et estimer la concentration de l'ADN en exécutant vos échantillons sur un gel de 0,8% STA gel d'agaroseINED avec 1ml bromure d'éthidium (BET) pendant la nuit. (Soyez extrêmement prudent lorsque vous utilisez EtBr est un mutagène connu et soupçonné d'être cancérogène. Assurez-vous de changer de gants souvent et évitez EtBr transfert du reste du laboratoire et à votre peau.) Charger les échantillons côté échelles d'ADN, qui servent de normes de taille et d'intensité (voir étape suivante).
2. Dans les premières voies de plusieurs, la charge d'échelles avec des bandes de différents poids moléculaires et des concentrations. Nous recommandons le schéma de chargement suivantes: dans les ruelles et prénom (voies ultrapériphériques), 10 pl de la charge de la 50ng/μl 1kb + ou échelle 2log. Dans voies 2,3 et 4, la charge 2 pl, 5 pl, et 10 pl, respectivement, de 50ng/μl λHindIII échelle. Enfin, la charge 5 pl par voie d'extrait d'ADN avec un colorant pour chaque échantillon.
3. Exécutez le gel à 15 volts pendant environ 16 heures (nous vous recommandons d'exécuter la nuit).
4. Le jour suivant, une photographie du gel en utilisant un système de gel UV de la documentation. Pour déterminer la gamme de poids moléculaire de votre ADN et de sa concentration, de comparer les bandes de l'échantillon à des bandes de l'échelle. L'ADN de bonne qualité aura de haut poids moléculaire (> 36kb), et montrent peu de signes de cisaillement / dégradation. Voir Figure 1.

Cinquième partie: Césium Centrifugation gradient de chlorure de

1. Si la qualité de l'ADN est bon et la quantité est suffisante, vous pouvez procéder à purifier l'ADN en effectuant un chlorure de césium (CsCl) centrifugation en gradient. Notez que cette étape de purification est facultatif et n'est pas nécessaire pour toutes les applications en aval (par exemple, si vous voulez générer des bibliothèques fosmide vous DEVEZ purifier, alors si vous voulez simplement de réaliser des réactions de PCR, la purification n'est généralement pas nécessaire). D'abord, l'étiquette d'un tube à centrifuger pour chaque échantillon.
2. Pour chaque tube à centrifuger, ajouter 160 mg de CsCl, 178 ul d'ADN génomique. Après l'ajout de CsCl et de l'ADN dans le tube, placer un petit morceau de parafilm sur le haut du tube et retourner doucement le tube dix à vingt fois afin de mélanger les composants. Ne pas mélanger par pipetage, qui peut causer de cisaillement de l'ADN. Ensuite, ajoutez 10 ul de 10 ug / ul EtBr à ce tube et mélanger de la même manière. (Soyez extrêmement prudent lorsque vous utilisez EtBr est un mutagène connu et soupçonné d'être cancérogène. Assurez-vous de changer de gants souvent et évitez EtBr transfert du reste du laboratoire et à votre peau.)
3. Assurez-vous que le poids de tous les tubes sont équilibrés avant centrifugation tels que les différences de poids entre les tubes sont inférieures à 1 mg.
4. Placer les tubes dans le rotor en utilisant hémostatique, fermer le couvercle et placer le rotor à l'intérieur du ultracentrifugation.
5. Fermez la porte d'ultracentrifugation. Vide sera appliquée dès que vous fermez la porte. Exécuter nuit à 100 000 tours par minute pendant 18 heures et de 20 ° C.
6. Lorsque la centrifugation est terminée, sortez les tubes du rotor à l'aide hémostatique et le placer sur un portoir.
7. Visualisez l'ADN avec transilluminateur lumière bleue, ou à défaut, utiliser la lumière UV à long longueur d'onde, dans une pièce sombre. Porter une paire de lunettes filtre ambre pour voir la bande d'ADN. Voir Figure 2.
8. Utiliser une seringue stérile et une aiguille 1cc (26G 5 / 8), retirer la bande d'ADN et de le placer dans un tube de 1,5 ml Eppendorf.
9. Pour aider à récupérer la plupart de l'ADN piégé dans l'espace vide dans la seringue, rincer la seringue avec 100 pi de TE et ajouter la solution rincé pour le tube. Préparer un tube avec 100 pi de tampon TE par échantillon afin d'éviter toute contamination croisée.
10. Pour supprimer EtBr partir de l'ADN, ajouter un volume égal d'eau saturée de butanol dans le tube, inverser les tubes doucement dix à vingt fois, centrifuger à 10000 rpm pendant 1 minute et jetez la couche supérieure.
11. Répéter le lavage jusqu'à ce que la couleur de butanol est transparent, 3 - 4 fois plus.
12. Place 4 ml de TE dans un tube à centrifuger Amicon Ultra et ajouter la solution d'ADN de haut.
13. Centrifuger à 3500 g à température ambiante, jusqu'à ce que le volume ADN est réduite à environ 100 à 500 ul (environ 6-7 minutes) et jeter le accréditives.
14. Ajouter 2 ml de TE Amicon filtre et centrifuger à 3500 g pendant 6 minutes, en veillant à utiliser une pointe de pipette propre pour chaque ajout afin d'éviter la contamination croisée. Répéter deux fois.
15. Concentré à un volume final de 50-100 ul par centrifugation supplémentaires si nécessaire et le transfert de la solution d'ADN sur le filtre dans un nouveau tube Eppendorf de 1,5 ml.
16. Ajouter 40 ul de TE au filtre Amicon pipette et de haut en bas le long des deux membranes de filtration pour laver tout ADN restants. Ajouter cette solution dans le tube de 5,15.
17. Placer un Microcon YM-30 unité de filtre dans un tube Microcon et prélaver le Microcon en ajoutant 200 ul d'eau à l'autoclave et centrifugation à 10000 rpm pendant 7 minutes.
18. Ajouter la solution d'ADN de 5,16 à l'Microcon prélavée afin de concentrer davantage l'ADN. Centrifuger à 5000 à 10000 g pendant 1 - 3 minutes. Vérifiez la quantité de liquidesur le filtre de centrifugation et de répéter jusqu'à ce que la quantité de liquide sur le filtre est réduite à environ 50 pi.
19. Placez l'unité de filtre à l'envers dans un tube et centrifuger Microcon nouvelles à 1000 g pendant 3 minutes. La quantité idéale de la solution concentrée est de 50-60 pi.
20. Mesurer et enregistrer la concentration de l'ADN sur un Nanodrop de vérifier la qualité de pointe (260 nm devrait être).
21. Transférer une petite aliquote de l'ADN dans un tube propre eppendorf pour travailler stocks et de geler à moins 20. Transférer le reste de l'ADN à un deuxième eppendorf propre et geler à moins 80.

Les résultats représentatifs:

Lorsque ce protocole est fait correctement, vous devriez voir une image du gel après l'étape 4.4 dans la détermination de la qualité de l'ADN similaire à la figure 1. Concentration d'ADN réels des extraits varie en fonction de la source de l'échantillon. Après l'étape de 5,7 dans la centrifugation en gradient de CsCl, l'ADN génomique éclairé par la lumière bleue devrait ressembler à la figure 2.

Figure 1. Agarose 0,8% l'image électrophorèse sur gel d'ADN de poids moléculaire élevé recueillies auprès de quatre profondeurs dans l'océan Pacifique subarctique (en double), colorées avec l'agent de intercalant bromure d'éthidium (10 mg / ml). Gel a été exécuté à 15V pour ~ 16hrs au 1X tampon de gel TBE cours d'exécution. Des bandes d'échantillon sont de bonne qualité montrant peu de signes de cisaillement mécanique (montre des bandes simples ou frottis, par opposition à bandes multiples) bien que les extraits 10m conserver certains ARN reporté (voir frottis dans l'intervalle de 0,5 à 2,0 kb).

Figure 2. Bande de l'ADN génomique éclairé par une lumière bleue après centrifugation en gradient de CsCl.

Discussion

Selon le nombre d'échantillons doivent être traitées, ce peut être une procédure prend beaucoup de temps à cause des deux étapes d'incubation d'une heure, et les lavages répétés et les étapes de centrifugation. Il est préférable de prévoir deux jours entiers pour cette procédure de laisser suffisamment de temps. S'il ya des problèmes pour obtenir le volume extrait final dans le tube de Amicon de réduire jusqu'à 200-500μl lors de la concentration de l'ADN et à laver, lave supplémentaires essayer de faire TE et centrifugations (répéter la troisième partie) jusqu'à ce que le volume approprié est les restes. Aussi, si l'extrait de chloroforme odeurs aiguë, il est préférable de ne lavages supplémentaires jusqu'à ce l'odeur diminue pour s'assurer que tous le chloroforme est enlevé. Encore une fois, tous les réactifs utilisés dans le présent protocole sont aliquotées des stocks de laboratoire travaillant en petits stocks-ce qui est très important d'éviter la contamination croisée de vos échantillons d'ADN et la contamination des stocks de laboratoire. Aussi, lors du pipetage, assurez-vous de changer d'embout de pipette pour chaque ajout afin d'éviter la contamination croisée.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 cc syringe (26G5/8 needle)	BD Biosciences	309597
1 ml syringe (26G5/8 needle)	BD Biosciences	309597
1.5ml eppendorf tubes	Eppendorf	0030 125.150
15ml tubes	Sigma-Aldrich	CLS430791
5cc syringe	BD Biosciences	309603
Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices	EMD Millipore	UFC801096	10,000 Nominal molecular weight limit
Butanol	Fisher Scientific	A383-1	Make it water saturated (butanol:water = 1:1)
Centrifuge rotor, JA5.3	Beckman Coulter Inc.	368690
Centrifuge, Avanti® J-E	Beckman Coulter Inc.	369003
Cesium chloride	Sigma-Aldrich	C4036
Chloroform:IAA (24:1)	Sigma-Aldrich	25666-500ML
Ethidium Bromide (EtBr)	Sigma-Aldrich	E1510-10ml
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma-Aldrich	E5134
Hybridization oven	Fisher Scientific	13-247-10	37°C & 55°C
Lysis Buffer			0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876-5G	125 mg in 1000 μl TE
Microcon® Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit	EMD Millipore	42410	50 bp cut off
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-10
Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1)	Sigma-Aldrich	77617-500ML
Proteinase K	Qiagen	19133
RNase A	Fisher Scientific	BP2539-100	10 μg/ml
Safe Imager™ Blue light transilluminator	Invitrogen	S37102
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L4509	20% SDS
Sterivex filters	Fisher Scientific	SVG010RS
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Table top centrifuge	Eppendorf	5415D
TE buffer, pH 8.0
Trizma® base	Sigma-Aldrich	T1503
Ultracentrifuge rotor, TLA 100	Beckman Coulter Inc.	343847
Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC)	Beckman Coulter Inc.	343775
Ultracentrifuge tube rack	Beckman Coulter Inc.	348302
Ultracentrifuge, Optima® Max	Beckman Coulter Inc.