DNA-extractie van 0,22 uM Sterivex Filters en Cesium Chloride dichtheidsgradiënt centrifugatie

Summary

We beschrijven een methode voor de extractie van een hoog moleculair gewicht genomische DNA van plankton biomassa geconcentreerd op 0,22 micrometer Sterivex filters, gevolgd door een cesium chloride dichtheidsgradiënt centrifugatie voor zuivering.

Abstract

Deze methode wordt gebruikt om een ​​hoog moleculair gewicht genomische DNA-extract van plankton biomassa geconcentreerd op 0,22 uM Sterivex filters die zijn behandeld met opslag / lysisbuffer en gearchiveerd bij -80 ° C, en dit met behulp van DNA een cesium chloride dichtheidsgradiënt te zuiveren. Het protocol begint met twee een-uur incubatie stappen om DNA te bevrijden van cellen en te verwijderen RNA. Vervolgens wordt een reeks van Fenol: zijn Chloroform Chloroform en extracties uitgevoerd, gevolgd door centrifugeren aan eiwitten en celmembraan componenten, collectie van het waterige DNA-extract, en een aantal buffer uitwisseling stappen te wassen en te concentreren het extract te verwijderen. Deel vijf beschrijft de optionele zuivering via cesium chloride dichtheidsgradiënt. Het wordt aanbevolen om met minder dan 15 monsters te werken in een keer om verwarring te voorkomen en te bezuinigen protocol tijd. De totale tijd die nodig is voor dit protocol is afhankelijk van het aantal monsters dat moet worden geëxtraheerd. Voor 10-15 monsters en ervan uitgaande dat de juiste centrifugeren apparatuur beschikbaar is, moet deze hele protocol duurt 3 dagen. Zorg ervoor dat u de hybridisatie ovens ingesteld op de temperatuur aan het begin van het proces.

Protocol

Opmerking: Alle gebruikte reagentia in dit protocol zijn gealiquoteerd van het laboratorium voorraden in kleinere werkvoorraden-dit is erg belangrijk om te voorkomen dat kruisbesmetting van je DNA-monsters en besmetting van lab voorraden. Ook, toen pipetteren, zorg ervoor dat pipetpunten te veranderen voor elke aanvulling op kruisbesmetting te voorkomen.

Deel een: Cell Lysis en Spijsvertering

1. Begin dit protocol door het ontdooien van de Sterivex filters die eerder geconcentreerd planktonische biomassa bevatten op het ijs. Voor de eenvoud, hier beschrijven we de procedure voor de verwerking van een apart filter. In de praktijk adviseren wij de verwerking van 16 of minder filters tegelijk.
2. Zodra het filter is ontdooid, beginnen de eerste van twee incubaties: een om de cellen te lyseren en te verwijderen RNA, en een af ​​te breken eiwitten. Voor de eerste incubatie, voeg 100 ul lysozym (125 mg in 1000 ui TE) en 20 ml RNase A (10 ug / ml) om de filter. Sluit het filter met Parafilm en laat het in de oven te draaien hybridisatie bij 37 ° C gedurende 1 uur.
3. Voor de volgende incubatie, voeg 100 ul proteïnase K en 100 ul 20% SDS aan het filter. Sluit met behulp van Parafilm en laat het aan een tot twee uur meer draaien in de hybridisatie oven, dit keer bij 55 ° C.
4. Met behulp van een injectiespuit 5cc, overdracht van de lysaat van de Sterivex filter in een 15 ml Falcon buis. Spoel het filter met 1 ml lysis buffer en voeg de spoel vloeistof om het lysaat in uw Falcon buis met behulp van de 5cc spuit. Nu heb je gelyseerd en verteerd je cellen, bent u klaar om hun DNA te halen.

Deel twee: DNA-extractie

1. De volgende stap is om de fenol-chloroform methode te gebruiken om het DNA uit je lysaat. Voeg een gelijke hoeveelheid (ongeveer 3 ml) van fenol: chloroform: isoamylalcohol (IAA) de lysaat buis, en zorg ervoor dat pipetpunten voor elke toevoeging te veranderen om kruisbesmetting te voorkomen. Vortex gedurende 10 seconden goed mengen.
2. Spin de buis bij 2500 g gedurende 5 minuten, zorg ervoor dat de centrifuge evenwichtig is. Tijdens het centrifugeren moet de fenol-chloroform-lysaat mengsel scheiden in twee lagen: een organische laag die het fenol, chloroform, en eiwitten uit je monster, op de bodem, en een waterige laag, die bestaat uit je DNA, water en andere meer hydrofiele moleculen, op de top.
3. Breng de waterige laag (met daarin uw DNA) in een nieuwe 15 ml Falcon buis. Wees voorzichtig dat u de interface contact met de pipetpunt (laat altijd een kleine hoeveelheid van de waterige laag achter).
4. Om deze nieuwe buis, voeg een gelijke hoeveelheid (ca. 3 ml) van Chloroform: IAA, en zorg ervoor dat pipetpunten voor elke toevoeging te veranderen om kruisbesmetting te voorkomen. Vortex gedurende 10 seconden. Deze stap helpt om alle resterende fenol te verwijderen uit uw DNA-monster.
5. Spin bij 2500 g gedurende 5 minuten of tot waterige laag is duidelijk. Overdracht waterlaag in een nieuwe, label Falcon buis en voeg 1 ml van TE bij pH 8,0, zorg dat u de interface contact met de pipetpunt (laat altijd een kleine hoeveelheid van de waterige laag achter). Deze waterige laag bevat uw DNA-extract.

Deel drie: DNA Concentratie en Wassen

1. De volgende stap is te wassen en het DNA-monster te concentreren in een 15 ml Amicon Ultra centrifugebuis. De Amicon buizen bestaan ​​uit een filter dat moleculen blijft op of boven een bepaald moleculair gewicht (het retentaat) en een buis om de stroom-door middel van vangstbeperkingen (het filtraat). In dit geval, het filter houdt je DNA (het retentaat). Breng uw DNA-extract van stap 2.5 om de filter compartiment van een Amicon Ultra buis.
2. Draaien op 3500 g gedurende 10 minuten. Controleer of er minder dan 1 ml vloeistof bewaard in de Amicon filter. Als er meer retentaat blijft, vul het filter met TE en weer draaien. Zorg ervoor dat u een frisse pipettip gebruiken voor iedere TE aanvulling op kruisbesmetting te voorkomen.
3. Verwijder de doorstroming, of het filtraat, naar een andere Falcon buis en sla het op in de koelkast totdat u bevestiging van uw uiteindelijke DNA product op een gel (vierde deel).
4. Voeg 2 ml TE-buffer om de Amicon filter en draaien op 3500 g gedurende 6 minuten, zorg ervoor dat u een frisse pipettip gebruiken voor elke TE aanvulling op kruisbesmetting te voorkomen. Zwembad filtraat met die uit stap 3.3 en sla in de koelkast.
5. Was het DNA twee keer meer met TE voor een totaal van drie wasbeurten (zorg ervoor dat u altijd een verse pipetpunt), en het opslaan van het filtraat elke keer (volgens de stappen 3.3 en 3.4). Voor de laatste was, spin tot 200 tot 500 ml van het retentaat blijft in de Amicon filter. Noteer het uiteindelijke volume en de overdracht van het retentaat (met uw DNA) om een ​​gelabeld 1,5 ml Eppendorf buis.

Deel vier: Bepaling van de DNA-Quality

1. Controleer de DNA-kwaliteit en een schatting van de concentratie van het DNA door het uitvoeren van uw monsters op een gel 0,8% agarosegel staINED met 1 ml ethidiumbromide (EtBr) 's nachts. (Wees uiterst voorzichtig bij het gebruik van EtBr-it is een bekend mutageen en verdacht carcinogeen. Zorg ervoor dat je vaak veranderen handschoenen en EtBr over te dragen aan de rest van het lab en om uw huid te voorkomen.) Laad de monsters naast DNA ladders, die dienen als omvang en intensiteit normen (zie volgende stap).
2. In de eerste paar rijstroken, belasting ladders met bands van verschillende molecuulgewichten en concentraties. Wij bevelen de volgende lading patroon: in de eerste en laatste rijstroken (buitenste rijstroken), load 10 ul van 50ng/μl van 1kb + of 2log ladder. In de lanen 2,3 en 4, belasting 2 pl, 5 ul, en 10 ul, respectievelijk van 50ng/μl λHindIII ladder. Ten slotte, last 5 ul per rijstrook van de DNA-extract met kleurstof voor elk monster.
3. Laat de gel op 15 volt voor ongeveer 16 uur (wij raden 's nachts lopen).
4. De volgende dag, de foto van de gel met een UV-gel documentatiesysteem. Voor het bepalen van het moleculair gewicht bereik van je DNA en de concentratie, vergelijk het monster bands bands van de ladders. Goede kwaliteit DNA zal een hoog molecuulgewicht (> 36kb), en tonen weinig tekenen van scheren / degradatie. Zie figuur 1.

Vijfde deel: Cesium Chloride Gradient Centrifugeren

1. Als de DNA-kwaliteit is goed en de hoeveelheid voldoende is, kunt u overgaan tot het DNA te zuiveren door het uitvoeren van een cesium chloride (CSCL) gradiënt centrifugatie. Merk op dat deze zuivering stap is optioneel en is niet noodzakelijk voor alle downstream toepassingen (bijvoorbeeld als je wilt fosmid bibliotheken u DIENT te zuiveren genereren, terwijl als je gewoon wilt PCR-reacties uit te voeren, de zuivering is meestal niet nodig). Ten eerste label een centrifugebuis voor elk monster.
2. Aan elke centrifugebuis, voeg 160 mg CsCl, 178 pl van genomisch DNA. Na het toevoegen van CsCl en DNA aan de buis, leg een klein stukje van parafilm op de top van de buis en voorzichtig omkeren van de buis tien tot twintig keer in om de componenten te mengen. Gaan niet samen door pipetteren, wat kan leiden tot afschuiving van het DNA. Voeg vervolgens 10 ui van 10 ug / ul EtBr om deze buis en meng dit op dezelfde manier. (Wees uiterst voorzichtig bij het gebruik van EtBr-it is een bekend mutageen en verdacht carcinogeen. Zorg ervoor dat je vaak veranderen handschoenen en EtBr over te dragen aan de rest van het lab en om uw huid te voorkomen.)
3. Zorg ervoor dat het gewicht van de buizen zijn afgesloten vóór centrifugeren zodanig dat het gewicht verschillen tussen de buizen zijn minder dan 1 mg.
4. Plaats de buizen in de rotor met behulp van hemostaat, sluit het deksel en plaats de rotor in de ultracentrifuge.
5. Sluit de ultracentrifuge deur. Vacuüm wordt zodra je de deur dicht worden toegepast. Lopen 's nachts op 100.000 toeren per minuut gedurende 18 uur en 20 ° C.
6. Wanneer wordt gecentrifugeerd is voltooid, nemen de buizen van de rotor met behulp van hemostaat en leg ze op een buis rek.
7. Visualiseer het DNA met blauw licht transilluminator, of indien niet beschikbaar, gebruik lange golflengte UV-licht, in een donkere kamer. Draag een paar oranje filter bril om de DNA-band te zien. Zie figuur 2.
8. Met behulp van een steriele 1cc spuit en naald (26G 5 / 8), verwijder DNA-band en plaats deze in een 1,5 ml Eppendorf buis.
9. Om u te helpen herstellen de meeste van de DNA opgesloten in de dode ruimte in de spuit, spoel spuit met 100 pi TE en voeg de gespoeld oplossing voor de buis. Bereid een buisje met 100 pi TE-buffer per monster, om kruisbesmetting te voorkomen.
10. Voor het verwijderen van EtBr uit het DNA, voeg een gelijk volume van water verzadigde butanol aan de buis, keren de buizen voorzichtig tien tot twintig keer, centrifugeer bij 10000 rpm gedurende 1 minuut en gooi de bovenste laag.
11. Herhaal het wassen totdat de kleur van butanol is transparant, 3 - 4 keer.
12. Plaats 4 ml TE in een Amicon Ultra centrifugebuis en voeg de DNA-oplossing van bovenaf.
13. Centrifugeer bij 3500 g bij kamertemperatuur, totdat het DNA volume is gereduceerd tot ongeveer 100-500 ui (ongeveer 6-7 minuten) en gooi de doorstroming.
14. Voeg 2 ml TE aan Amicon filter en centrifugeer bij 3500 g gedurende 6 minuten, zorg ervoor dat u een frisse pipettip te gebruiken voor elke toevoeging om kruisbesmetting te voorkomen. Tweemaal herhalen.
15. Concentreren tot een eindvolume van 50-100 ul door extra centrifugeren als nodig en breng de DNA-oplossing op het filter om een ​​nieuwe 1,5 ml Eppendorf buis.
16. Voeg 40 ul TE aan de Amicon filter en pipet op en neer langs beide filter membranen uit te spoelen eventuele resterende DNA. Voeg deze oplossing toe aan de buis in 5.15.
17. Plaats een Microcon YM-30 filter-eenheid in een Microcon buis en voorwas de Microcon door de toevoeging van 200 ul geautoclaveerd water en centrifugeren bij 10000 rpm gedurende 7 minuten.
18. Voeg de DNA-oplossing van 5,16 voor de voorwas Microcon om verder te concentreren het DNA. Centrifugeer bij 5.000 tot 10.000 g gedurende 1 - 3 minuten. Controleer de hoeveelheid vloeistofop het filter en herhaal centrifugeren totdat het bedrag van de vloeistof op het filter wordt teruggebracht tot ongeveer 50 pi.
19. Plaats het filter op zijn kop in een nieuw Microcon buis en centrifugeer bij 1000 g gedurende 3 minuten. De ideale hoeveelheid geconcentreerde oplossing van 50-60 ul.
20. Meet en noteer de concentratie van het DNA op een Nanodrop en controleer piek kwaliteit (moet worden 260nm).
21. Overdracht van een kleine hoeveelheid van het DNA een schoon eppendorfbuisje voor de werkvoorraad en bevriezen bij min 20. Breng de rest van het DNA om een ​​tweede schone Eppendorf en bevriezen bij min 80.

Representatieve resultaten:

Wanneer dit protocol goed wordt gedaan, moet u een gel afbeelding te zien na stap 4.4 bij de bepaling van de DNA-kwaliteit vergelijkbaar is met een figuur. Werkelijke DNA-concentratie van extracten zal variëren afhankelijk van de bron van het monster. Na stap 5.7 in CsCl gradiënt centrifugatie, moet genomisch DNA verlicht door blauw licht lijken op figuur 2.

Figuur 1. 0,8% agarosegel elektroforese beeld van een hoog moleculair gewicht DNA verzameld uit vier diepten in de subarctische Stille Oceaan (in tweevoud), gekleurd met de intercalerende stof ethidiumbromide (10 mg / ml). Gel werd uitgevoerd bij 15V voor ~ 16 uur in 1x TBE gel lopen buffer. Monster banden zijn van goede kwaliteit met weinig bewijs van mechanische afschuiving (toont enkele bands of vlekken in tegenstelling tot meerdere bands), hoewel de 10m extracten behouden sommige RNA-overdracht (zie uitstrijkje in de 0,5 tot 2,0 Kb bereik).

Figuur 2. Genomic DNA-band verlicht door blauw licht na CsCl gradiënt centrifugatie.

Discussion

Afhankelijk van het aantal monsters dienen te worden verwerkt, kan dit een tijdrovende procedure als gevolg van de twee een uur incubatie stappen, en de herhaalde wast en centrifugeren stappen. Het beste is om twee hele dagen voor deze procedure van plan om veel tijd te verlaten. Als er problemen zijn het krijgen van het uiteindelijke extract volume in de Amicon buis naar beneden te reduceren tot 200-500μl tijdens de DNA-concentratie en het wassen, probeer dan extra TE wast en centrifugations (herhaling deel drie) tot de juiste volume is overgebleven. Ook, indien het extract ruikt acuut van chloroform, is het het beste om extra wasbeurten doen tot de geur vermindert om te controleren of alle van de chloroform wordt verwijderd. Nogmaals, zijn alle gebruikte reagentia in dit protocol gealiquoteerd van het laboratorium voorraden in kleinere werkvoorraden-dit is erg belangrijk om te voorkomen dat kruisbesmetting van je DNA-monsters en besmetting van lab voorraden. Ook, toen pipetteren, zorg ervoor dat pipetpunten te veranderen voor elke aanvulling op kruisbesmetting te voorkomen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 cc syringe (26G5/8 needle)	BD Biosciences	309597
1 ml syringe (26G5/8 needle)	BD Biosciences	309597
1.5ml eppendorf tubes	Eppendorf	0030 125.150
15ml tubes	Sigma-Aldrich	CLS430791
5cc syringe	BD Biosciences	309603
Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices	EMD Millipore	UFC801096	10,000 Nominal molecular weight limit
Butanol	Fisher Scientific	A383-1	Make it water saturated (butanol:water = 1:1)
Centrifuge rotor, JA5.3	Beckman Coulter Inc.	368690
Centrifuge, Avanti® J-E	Beckman Coulter Inc.	369003
Cesium chloride	Sigma-Aldrich	C4036
Chloroform:IAA (24:1)	Sigma-Aldrich	25666-500ML
Ethidium Bromide (EtBr)	Sigma-Aldrich	E1510-10ml
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma-Aldrich	E5134
Hybridization oven	Fisher Scientific	13-247-10	37°C & 55°C
Lysis Buffer			0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876-5G	125 mg in 1000 μl TE
Microcon® Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit	EMD Millipore	42410	50 bp cut off
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-10
Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1)	Sigma-Aldrich	77617-500ML
Proteinase K	Qiagen	19133
RNase A	Fisher Scientific	BP2539-100	10 μg/ml
Safe Imager™ Blue light transilluminator	Invitrogen	S37102
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L4509	20% SDS
Sterivex filters	Fisher Scientific	SVG010RS
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Table top centrifuge	Eppendorf	5415D
TE buffer, pH 8.0
Trizma® base	Sigma-Aldrich	T1503
Ultracentrifuge rotor, TLA 100	Beckman Coulter Inc.	343847
Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC)	Beckman Coulter Inc.	343775
Ultracentrifuge tube rack	Beckman Coulter Inc.	348302
Ultracentrifuge, Optima® Max	Beckman Coulter Inc.