ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Vi beskriver en metod för utvinning av hög molekylvikt genomisk DNA från planktoniska biomassa koncentreras på 0,22 ìm Sterivex filter, följt av cesiumklorid densitetsgradient centrifugering för rening.
Abstract
Denna metod används för att extrahera hög molekylvikt DNA vikt genomisk från planktoniska biomassa koncentreras på 0,22 mikroM Sterivex filter som har behandlats med förvaring / lyseringsbuffert och arkiveras vid -80 ° C, och att rena detta DNA med hjälp av en cesium gradient klorid densitet. Protokollet inleds med två en-timmes inkubation åtgärder för att frigöra DNA från celler och ta bort RNA. Nästa, en serie Fenol: är Kloroform och kloroform extrakt följt av centrifugering för att avlägsna proteiner och cell-komponenter membran, insamling av vattenfasen DNA-extrakt, och flera buffert steg utbyte för att tvätta och koncentrera extraktet. Femte delen beskriver valfria rening via cesiumklorid densitetsgradient. Det rekommenderas att arbeta med färre än 15 prover på en gång för att undvika förvirring och minska protokoll tid. Den totala tiden som krävs för detta protokoll beror på antalet prover som skall extraheras. För 10-15 prover och antar rätt centrifugeringen utrustningen är tillgänglig bör detta hela protokollet ta 3 dagar. Se till att du har hybridisering ugnar inställd temperatur i början av processen.
Protocol
Anmärkning: Alla reagenser som används i detta protokoll alikvoteras från lab lager i mindre arbetsgrupper lager-detta är mycket viktigt för att undvika korskontaminering av ditt DNA-prov och förorening av lab lager. Även vid pipettering, se till att ändra pipettspetsar för varje tillägg för att undvika korskontaminering.
Del ett: cellslys och matsmältning
- Börja detta protokoll med upptining av Sterivex filter som innehåller tidigare koncentrerat planktoniska biomassa på is. För enkelhetens skull, här beskriver vi förfarandet för bearbetning ett enskilt filter. I praktiken rekommenderar vi behandling 16 eller färre filter åt gången.
- När filtret har tinat, börjar den första av två inkubationer: en för att lysera cellerna och ta bort RNA och en att bryta ner proteiner. För första inkubationen, tillsätt 100 l lysozym (125 mg i 1000 l TE) och 20 ml RNas A (10 mikrogram / ml) till filtret. Återförslut filtret med Parafilm och låt det rotera i hybridisering ugn vid 37 ° C i 1 timme.
- För nästa inkubationen, tillsätt 100 l proteinas K och 100 l 20% SDS till filtret. Återförslut med Parafilm och lämna den att rotera en till två timmar mer i hybridisering ugnen, denna gång vid 55 ° C.
- Med hjälp av en 5cc spruta, överför lysat från Sterivex filter till en 15 ml Falcon rör. Skölj filtret med 1 ml lyseringsbuffert och tillsätt skölj vätska till lysat i din Falcon tub med 5cc sprutan. Nu när du har lyseras och smält dina celler, är du redo att extrahera deras DNA.
Del två: DNA-extraktion
- Nästa steg är att använda fenol-kloroform metod för att extrahera DNA från din lysat. Tillsätt en motsvarande volym (ca 3 ml) av Fenol: Kloroform: Isoamyl Alkohol (IAA) till lysat röret, och se till att ändra pipettspetsar för varje tillsats för att undvika korskontaminering. Vortexa i 10 sekunder för att blanda väl.
- Spin röret vid 2500 gi 5 minuter och se till att centrifugen är balanserad. Under centrifugeringen bör fenol-kloroform-lysat blandningen separat i två skikt: ett organiskt lager som innehåller fenol, kloroform och proteiner från ditt prov, på botten, och en vattenskiktet, som består av ditt DNA, vatten och andra flera hydrofila molekyler, på topp.
- Överför vattenskiktet (som innehåller ditt DNA) i en ny 15 ml Falcon rör. Var noga med att inte röra gränssnittet med pipettspetsen (alltid lämna en liten del av vattenskiktet bakom).
- I detta nya rör, tillsätt en lika stor volym (ca 3 ml) av kloroform: IAA och se till att ändra pipettspetsar för varje tillsats för att undvika korskontaminering. Vortexa i 10 sekunder. Detta steg hjälper till att avlägsna alla återstående fenol från ditt DNA-prov.
- Snurra på 2500 g i 5 minuter eller tills vattenskiktet är klar. Överför vattenskiktet i en ny märkning, Falcon rör och tillsätt 1 ml TE vid pH 8,0 och var försiktig att inte röra vid gränssnittet med pipettspetsen (alltid lämna en liten del av vattenskiktet bakom). Detta vattenskiktet innehåller din DNA-extrakt.
Del tre: DNA-koncentration och tvätt
- Nästa steg är att tvätta och koncentrera DNA-provet i ett 15 ml Amicon Ultra centrifugrör. Den Amicon rör består av ett filter som behåller molekyler vid eller över en viss molekylvikt (den retentate) och ett rör för att fånga genomströmning (filtratet). I detta fall behåller filtrera dina DNA (retentate). Överför dina DNA-extrakt från steg 2,5 till filtret fack i en Amicon Ultra rör.
- Spin vid 3500 g under 10 minuter. Kontrollera att det finns mindre än 1 ml vätska kvar i Amicon filtret. Om fler retentate kvarstår fylla filtret med TE och snurra igen. Se till att använda en ny pipettspets för varje TE Förutom att undvika korskontaminering.
- Ta bort genomströmning eller filtratet till en annan Falcon röret och spara det i kylskåpet tills du har bekräftat din slutliga DNA produkten på en gel (fjärde delen).
- Tillsätt 2 ml TE buffert till Amicon filtret och snurra på 3500 g under 6 minuter, var noga med att använda en ny pipettspets för varje TE Förutom att undvika korskontaminering. Pool filtratet med det från steg 3,3 och spara i kylen.
- Tvätta DNA ytterligare två gånger med TE för totalt tre tvättningar (var noga med att alltid använda en ny pipettspets) och spara filtratet varje gång (enligt steg 3.3 och 3.4). För den sista tvättningen, snurra till 200 till 500 ml retentate kvar i Amicon filtret. Spela in den slutliga volymen och överföra retentate (som innehåller ditt DNA) till en märkt 1,5 ml Eppendorf-rör.
Del fyra: Bestämning av DNA-kvalitet
- Kontrollera DNA-kvalitet och uppskatta koncentrationen av DNA genom att köra ut dina prover på en gel 0,8% agarosgel STAINED med 1 ml etidiumbromid (EtBr) över natten. (Var ytterst försiktig när du använder EtBr-det är ett känt mutagent och misstänkt cancerframkallande. Se till att byta handskar ofta och undvika EtBr överföring till resten av labbet och på huden.) Ladda prover bredvid DNA-stegar, som fungerar som storlek och intensitet standarder (se nästa steg).
- I den första flera filer, ladda stegar med band av olika molekylvikt och koncentration. Vi rekommenderar följande lastning mönster: i första och sista körfält (yttersta körfält), belastning 10 ìl av 50ng/μl av 1KB + eller 2log stege. I körfält 2,3 och 4, ladda 2 l, 5 l och 10 l respektive av 50ng/μl λHindIII stege. Slutligen last 5 l per körfält DNA-extrakt med färg för varje prov.
- Kör gelen vid 15 volt i ca 16 timmar (vi rekommenderar att du kör över natten).
- Nästa dag, Fotografera gelen med UV-system gel dokumentation. För att bestämma molekylvikten utbud av ditt DNA och dess koncentration, jämföra provet band till band av stegar. Bra kvalitet DNA kommer att ha höga molekylvikt (> 36kb), och visar lite tecken på skjuvning / nedbrytning. Se figur 1.
Del fem: cesiumklorid Gradient Centrifugering
- Om DNA-kvaliteten är bra och kvantitet är tillräckligt kan du fortsätta att rena DNA genom att utföra en cesiumklorid (CsCl) gradient centrifugering. Observera att detta reningssteg är frivilligt och är inte nödvändigt för alla nedströms program (till exempel om du vill generera fosmid bibliotek du BÖR renar, medan om du bara vill utföra PCR-reaktioner, är rening vanligtvis inte nödvändig). Först, märka ett centrifugrör för varje prov.
- Till varje centrifugrör, tillsätt 160 mg CsCl, 178 ìl av arvsmassans DNA. Efter att ha lagt CsCl och DNA i röret, placera en liten bit av parafilm ovanpå röret och vänd försiktigt röret tio till tjugo gånger för att blanda komponenterna. Blanda inte genom att pipettera, vilket kan orsaka klippning av DNA. Lägg sedan till 10 ìl av 10 mikrogram / l EtBr detta röret och blanda det på samma sätt. (Var ytterst försiktig när du använder EtBr-det är ett känt mutagent och misstänkt cancerframkallande. Se till att byta handskar ofta och undvika EtBr överföring till resten av labbet och på huden.)
- Se till att vikten av alla rören är balanserade innan centrifugering så att vikten skillnader mellan rören är mindre än 1 mg.
- Placera rören i rotorn med hjälp av hemostat, stäng locket och placera rotorn inuti ultracentrifugen.
- Stäng ultracentrifugen dörren. Vakuum kommer att tillämpas så fort du stänger dörren. Kör övernattning på 100.000 rpm i 18 timmar och 20 ° C.
- När centrifugeringen är klar, ta ut rören från rotorn med hjälp av hemostat och placera den på ett rör rack.
- Visualisera DNA med blått ljus transilluminator, eller om tillgänglig kan du använda långa ljusets våglängd UV, i ett mörkt rum. Bära ett par orange-filter glasögon för att se DNA-bandet. Se figur 2.
- Med en steril 1 ml spruta och kanyl (26G 5 / 8), ta bort DNA-bandet och placera den i ett 1,5 ml Eppendorf-rör.
- För att hjälpa återställa de flesta av de DNA instängda i Dead Space i sprutan, skölj spruta med 100 l TE och tillsätt sköljas lösningen till röret. Förbered ett rör med 100 l TE buffert per prov för att förhindra korskontaminering.
- För att ta bort EtBr från DNA, lägg en lika stor volym vattenmättad butanol till röret, vänd rören försiktigt tio till tjugo gånger, centrifugera vid 10000 rpm i 1 minut och släng det översta lagret.
- Upprepa tvätt tills färgen av butanol är transparent, 3 - 4 gånger.
- Tillsätt 4 ml TE i en Amicon Ultra centrifugrör och tillsätt DNA lösningen från ovan.
- Centrifugera vid 3500 g vid rumstemperatur, tills DNA volymen reducerats till ca 100-500 l (ca 6-7 minuter) och kassera genomströmning.
- Lägg 2ml TE till Amicon filtret och centrifugera vid 3500 g under 6 minuter, var noga med att använda en ny pipettspets för varje tillsats för att undvika korskontaminering. Upprepa två gånger.
- Koncentrera till en slutlig volym på 50-100 l genom ytterligare centrifugering vid behov och överför DNA lösningen på filtret till ett nytt 1,5 ml Eppendorf-rör.
- Tillsätt 40 l TE till Amicon filtret och pipettera upp och ned längs båda filtret membran att tvätta bort kvarvarande DNA. Häll denna lösning i röret i 5,15.
- Placera en Microcon YM-30 filterenhet till ett Microcon rör och förtvätt de Microcon genom att tillsätta 200 l autoklaveras vatten och centrifugering vid 10000 rpm i 7 minuter.
- Tillsätt DNA-lösning från 5,16 till förtvättas Microcon för att ytterligare koncentrera DNA. Centrifugera vid 5 till 1000 gi 1 - 3 minuter. Kontrollera hur mycket vätskapå filtret och upprepa centrifugering tills mängden vätska på filtret är reducerad till ca 50 l.
- Placera aggregatet upp och ner i en ny Microcon rör och centrifugera vid 1000 g under 3 minuter. Den idealiska kvantitet koncentrerad lösning är 50-60 l.
- Mät och notera koncentrationen av DNA på en Nanodrop och kontrollera topp kvalitet (ska vara 260nm).
- Överför en liten delmängd av DNA till ett rent Eppendorf-rör för arbete lager och frysa vid minus 20. Överföring resten av DNA till en andra rent Eppendorf och frysa vid minus 80.
Representativa resultat:
När detta protokoll görs korrekt bör du se en bild av gelen efter steg 4,4 i Fastställande av DNA-kvalitet liknande figur 1. Faktisk DNA-koncentration av extrakt kommer att variera beroende på källan av provet. Efter steg 5,7 i CsCl lutning centrifugeringen bör genomiska DNA belyst med blått ljus liknar figur 2.
Figur 1. 0,8% agarosgelelektrofores bild med hög molekylvikt DNA samlas in från fyra djup i subarktiska Stilla havet (i duplikat), färgade med intercalating agenten etidiumbromid (10 mg / ml). Gel kördes på 15V för ~ 16hrs i 1X TBE gelen löpande buffert. Exempel på band är av god kvalitet visar få tecken på mekanisk skjuvning (visar enstaka band eller fläckar i motsats till flera band) även om 10m utdragen behåller vissa RNA föra över (se smeta på 0,5 till 2,0 Kb räckvidd).
Figur 2. Genomiskt DNA band belyst med blått ljus efter CsCl gradient centrifugering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beroende på hur många prover som ska bearbetas, kan detta vara en tidskrävande procedur på grund av de två en-timmes inkubation steg, och de upprepade tvättar och steg centrifugering. Det är bäst att planera två hela dagar för detta förfarande att lämna gott om tid. Om det finns problem att få den slutliga extrakt volymen i Amicon röret för att minska ner till 200-500μl under DNA-koncentration och tvättning, prova att göra ytterligare TE tvättar och centrifugering (upprepa tredje delen) tills rätt volym är överblivna. Dessutom, om utdraget luktar akut kloroform, är det bäst att göra ytterligare tvättar tills lukten minskar för att se alla av kloroform tas bort. Återigen är alla reagenser som används i detta protokoll alikvoteras från lab lager i mindre arbetsgrupper lager-detta är mycket viktigt för att undvika korskontaminering av ditt DNA-prov och förorening av lab lager. Även vid pipettering, se till att ändra pipettspetsar för varje tillägg för att undvika korskontaminering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill tacka det kanadensiska institutet för innovation, British Columbia Kunskap utvecklingsfonden och Statens Sciences and Engineering Research Council (NSERC) i Kanada för att stödja pågående studier på låg syre regioner i kustnära och öppna hav vatten. JJW stöddes av stipendier från NSERC och DAW stöddes av stipendier från NSERC, Killam och Tula stiftelsen finansierade Centrum för Mikrobiell diversitet och evolution. SL fick stöd av Tula stiftelsen finansierade Centrum för Mikrobiell diversitet och evolution.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 cc syringe (26G5/8 needle) | BD Biosciences | 309597 | |
| 1 ml syringe (26G5/8 needle) | BD Biosciences | 309597 | |
| 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 15ml tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 5cc syringe | BD Biosciences | 309603 | |
| Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices | EMD Millipore | UFC801096 | 10,000 Nominal molecular weight limit |
| Butanol | Fisher Scientific | A383-1 | Make it water saturated (butanol:water = 1:1) |
| Centrifuge rotor, JA5.3 | Beckman Coulter Inc. | 368690 | |
| Centrifuge, Avanti® J-E | Beckman Coulter Inc. | 369003 | |
| Cesium chloride | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| Chloroform:IAA (24:1) | Sigma-Aldrich | 25666-500ML | |
| Ethidium Bromide (EtBr) | Sigma-Aldrich | E1510-10ml | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C |
| Lysis Buffer | 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3) | ||
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-5G | 125 mg in 1000 μl TE |
| Microcon® Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | 42410 | 50 bp cut off |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | |
| RNase A | Fisher Scientific | BP2539-100 | 10 μg/ml |
| Safe Imager™ Blue light transilluminator | Invitrogen | S37102 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L4509 | 20% SDS |
| Sterivex filters | Fisher Scientific | SVG010RS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| TE buffer, pH 8.0 | |||
| Trizma® base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Ultracentrifuge rotor, TLA 100 | Beckman Coulter Inc. | 343847 | |
| Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC) | Beckman Coulter Inc. | 343775 | |
| Ultracentrifuge tube rack | Beckman Coulter Inc. | 348302 | |
| Ultracentrifuge, Optima® Max | Beckman Coulter Inc. |
References
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).
- DeLong, E. F. Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Stein, J. L., Marsh, T. L. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).
- Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).
Tags
Molekylärbiologi mikrobiologi havsvatten DNA-extraktion cesiumklorid densitetsgradient centrifugeringErratum
Formal Correction: Erratum: DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014.
Citeable Link.
A correction was made to "DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 ml RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 μl RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
