Extracción de ADN de 0,22 M Filtros Sterivex y centrifugación de densidad de cloruro de cesio Gradient

Summary

Se describe un método para la extracción de ADN de alto peso molecular genómico a partir de biomasa planctónica se concentró en 0,22 micras filtros Sterivex, seguido por centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio para la purificación.

Abstract

Este método se utiliza para extraer el ADN de alto peso molecular genómico a partir de biomasa planctónica se concentró en 0,22 M filtros Sterivex que han sido tratados con buffer de almacenamiento / lisis y archivados a -80 ° C, y para purificar el ADN utilizando un gradiente de densidad de cloruro de cesio. El protocolo se inicia con dos etapas de incubación de una hora para liberar el ADN de las células y eliminar el ARN. A continuación, una serie de fenol: cloroformo y cloroformo extracciones se llevan a cabo, seguido por centrifugación para separar las proteínas y los componentes de la membrana celular, la recolección del extracto acuoso de ADN, y varias medidas de cambio de amortiguación para el lavado y concentrar el extracto. Quinta Parte describe la purificación opcional a través de gradiente de densidad de cloruro de cesio. Se recomienda trabajar con menos de 15 muestras al mismo tiempo para evitar la confusión y reducir el tiempo de protocolo. El tiempo total requerido para este protocolo depende del número de muestras que se extraen. De 10 a 15 muestras y suponiendo que el equipo de centrifugación adecuada está disponible, este protocolo completo debe tomar 3 días. Asegúrese de tener los hornos de hibridación para configurar la temperatura en el inicio del proceso.

Protocol

Nota: Todos los reactivos utilizados en este protocolo que se distribuyan de las existencias de laboratorio que trabajan en pequeñas poblaciones-esto es muy importante para evitar la contaminación cruzada de muestras de ADN y la contaminación de las reservas de laboratorio. Además, al pipetear, asegúrese de cambiar las puntas de la pipeta para cada adición para evitar la contaminación cruzada.

Primera parte: lisis celular y la digestión

1. Comience este protocolo por el deshielo de los filtros que contienen Sterivex biomasa planctónica previamente concentrada en el hielo. Para simplificar, aquí se describe el procedimiento para la tramitación de un filtro individual. En la práctica, se recomienda el procesamiento de 16 o menos filtros a la vez.
2. Una vez que el filtro se ha derretido, comenzará el primero de dos incubaciones: una para lisar las células y eliminar el ARN, y uno para romper las proteínas. Para la primera incubación, añadir 100 l de lisozima (125 mg en 1000 l TE) y 20 ml RNasa A (10 mg / ml) en el filtro. Cerrar de nuevo el filtro con Parafilm y se deja de girar en el horno de hibridación a 37 ° C durante 1 hora.
3. Para la incubación siguiente, añadir 100 l de proteinasa K y 100 l 20% de SDS al filtro. Cerrar de nuevo con Parafilm y se deja de girar una o dos horas más en el horno de hibridación, esta vez a 55 ° C.
4. Con una jeringa de 5 cc, la transferencia del lisado del filtro Sterivex en un tubo Falcon de 15 ml. Enjuagar el filtro con una solución amortiguadora de lisis ml y agregar el líquido de enjuague para el lisado en su tubo Falcon con la jeringa de 5 cc. Ahora que ha lisan y digieren las células, usted está listo para extraer su ADN.

Segunda parte: La extracción de ADN

1. El siguiente paso es utilizar el método de fenol-cloroformo para extraer el ADN de su lisado. Añadir un volumen igual (alrededor de 3 ml) de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (IAA) en el tubo de lisado, asegurándose de que cambie la punta de la pipeta para cada Además de evitar la contaminación cruzada. Vortex durante 10 segundos para mezclar bien.
2. Girar el tubo a 2.500 g durante 5 minutos, asegurándose de que la centrífuga se equilibra. Durante la centrifugación, la mezcla de fenol-cloroformo-lisado se separan en dos capas: una capa orgánica que contiene el fenol cloroformo, y las proteínas de la muestra, en la parte inferior y una capa acuosa, que consiste en su ADN, el agua y otros moléculas más hidrófilas, en la parte superior.
3. La transferencia de la capa acuosa (que contiene el ADN) en un nuevo tubo de 15 ml Falcon. Tenga cuidado de no tocar la interfaz con la punta de la pipeta (siempre dejar una pequeña cantidad de la capa acuosa detrás).
4. Con este nuevo tubo, añadir un volumen equivalente (aprox. 3 ml) de cloroformo: IAA, asegurándose de que cambie la punta de la pipeta para cada Además de evitar la contaminación cruzada. Vortex durante 10 segundos. Este paso ayuda a eliminar cualquier resto de fenol a partir de su muestra de ADN.
5. Giran a 2500 g por 5 minutos o hasta que la capa acuosa es clara. Transferencia de fase acuosa en un nuevo tubo, llamado Falcon, y añadir 1 ml de TE pH 8.0, teniendo cuidado de no tocar la interfaz con la punta de la pipeta (siempre dejar una pequeña cantidad de la capa acuosa detrás). Esta capa acuosa contiene el extracto de ADN.

Tercera parte: La concentración de ADN y de lavado

1. El siguiente paso es lavar y concentrar la muestra de ADN en un tubo de 15 ml centrífuga Amicon Ultra. Los tubos Amicon consiste en un filtro que retiene las moléculas iguales o superiores a un peso determinado molecular (el concentrado) y un tubo para captar el flujo a través de (el filtrado). En este caso, el filtro retiene su ADN (el material retenido). Transfiere tus extraer el ADN de paso de 2,5 a el compartimiento del filtro de un tubo de Amicon Ultra.
2. Giran a 3500 g durante 10 minutos. Asegúrese de que hay menos de 1 ml de líquido retenido en el filtro Amicon. Si se mantiene más concentrado, vuelva a llenar el filtro con TE y girar de nuevo. Asegúrese de usar una punta de pipeta para cada TE Además de evitar la contaminación cruzada.
3. Retire el flujo a través, o filtrado, a otro tubo Falcon y guardarlo en la nevera hasta que haya confirmado su producto final de ADN en un gel (cuarta parte).
4. Añadir 2 ml de buffer TE con el filtro Amicon y giran a 3.500 g durante 6 minutos, asegurándose de usar una punta de pipeta para cada adición TE para evitar la contaminación cruzada. Piscina con filtrado que desde el paso 3.3 y guardar en la nevera.
5. Lavar el ADN dos veces más con TE para un total de tres lavados (asegurándose de utilizar siempre una punta de pipeta), y el ahorro del filtrado cada vez (como pasos por 3.3 y 3.4). Para el último lavado, centrifugado hasta 200 a 500 ml de los restos de material retenido en el filtro Amicon. Registre el volumen final y la transferencia del concentrado (que contiene el ADN) a una etiqueta del tubo Eppendorf de 1,5 ml.

Cuarta parte: Determinación de la calidad del ADN

1. Comprobar la calidad del ADN y estimar la concentración del ADN mediante la ejecución de sus muestras en un gel de 0,8% en gel de agarosa estacionesINED con 1 ml de bromuro de etidio (EtBr) durante la noche. (Tenga mucho cuidado cuando se utiliza bromuro de etidio, que es un mutágeno conocido y carcinógeno. Asegúrese de cambiar los guantes con frecuencia y evitar EtBr traslado al resto del laboratorio y para la piel.) Cargar las muestras de ADN junto a las escaleras, que sirven como tamaño y la intensidad de las normas (ver paso siguiente).
2. En el primero de varios carriles, la carga de las escaleras con bandas de diferentes pesos moleculares y concentraciones. Se recomienda el patrón de carga siguientes: en el primero y el último carril (carril externo), carga de 10 l de 50ng/μl de 1kb + o escalera 2log. En los carriles de 2,3 y 4, l carga de 2, l 5 y 10 l, respectivamente, de 50ng/μl escalera λHindIII. Por último, la carga de 5 l por vía de extracción de ADN con tinte para cada muestra.
3. Correr el gel a 15 voltios durante aproximadamente 16 horas (se recomienda ejecutar durante la noche).
4. Al día siguiente, la fotografía del gel usando un sistema de documentación de gel UV. Para determinar el rango de peso molecular de su ADN y su concentración, comparar las bandas de la muestra a las bandas de las escaleras. ADN de buena calidad se han elevado peso molecular (> 36 kb), y muestran poca evidencia de corte / degradación. Véase la figura 1.

Parte Cinco: La centrifugación gradiente de cloruro de cesio

1. Si la calidad del ADN es bueno y la cantidad es suficiente, se puede proceder a purificar el ADN mediante la realización de un cloruro de cesio (CsCl) gradiente de centrifugación. Tenga en cuenta que esta etapa de purificación es opcional y no es necesario que todas las aplicaciones posteriores (por ejemplo, si desea generar bibliotecas fosmid se debe purificar, mientras que si simplemente desea llevar a cabo reacciones de PCR, la purificación no suele ser necesario). Primero, etiquete un tubo de centrífuga para cada muestra.
2. Para cada tubo de centrífuga, añadir 160 mg de CsCl, 178 l de ADN genómico. Después de la adición de CsCl y el ADN en el tubo, coloque un pequeño trozo de parafina en la parte superior del tubo y suavemente invierta el tubo de diez a veinte veces para mezclar los componentes. No mezclar con la pipeta, que puede causar una ruptura del ADN. A continuación, añadir 10 l de 10 mg / l EtBr a este tubo y mezclar en la misma forma. (Tenga mucho cuidado cuando se utiliza bromuro de etidio, que es un mutágeno conocido y carcinógeno. Asegúrese de cambiar los guantes con frecuencia y evitar EtBr traslado al resto del laboratorio y para la piel.)
3. Asegúrese de que el peso de todos los tubos están en equilibrio antes de la centrifugación de tal manera que las diferencias de peso entre los tubos son inferiores a 1 mg.
4. Colocar los tubos en la pinza del rotor utilizando, cierre la tapa y colocar el rotor dentro de la ultracentrífuga.
5. Cierre la puerta de ultracentrifugación. Vacío se aplicará tan pronto como se cierre la puerta. Realizadas por la noche a 100.000 rpm durante 18 horas y 20 ° C.
6. Cuando se haya completado la centrifugación, sacar los tubos del rotor con pinza hemostática y colocarla en un bastidor de tubo.
7. Visualizar el ADN con transiluminador de luz azul, o en su defecto, utilizar la luz UV de longitud de onda larga, en un cuarto oscuro. Use un par de gafas de filtro de color ámbar para ver la banda de ADN. Véase la figura 2.
8. Con una jeringa estéril de 1 cc y una aguja (26G 5 / 8), quite la banda de ADN y lo coloca en un tubo Eppendorf de 1,5 ml.
9. Para ayudar a recuperar la mayor parte del ADN atrapado en el espacio muerto en la jeringa, enjuague la jeringa con 100 l TE y la solución de enjuagar el tubo. Preparar un tubo con 100 l de buffer TE por muestra con el fin de evitar la contaminación cruzada.
10. Para eliminar EtBr a partir del ADN, añadir un volumen igual de agua saturada de butanol en el tubo, invertir los tubos suavemente diez a veinte veces, se centrifuga a 10000 rpm durante 1 minuto y descartar la capa superior.
11. Repetir el lavado hasta que el color de butanol es transparente, 3 - 4 veces más.
12. Colocar 4 ml TE en un tubo de centrífuga Amicon Ultra y la solución de ADN de más arriba.
13. Centrifugar a 3500 g, a temperatura ambiente, hasta que el volumen del ADN se reduce a aproximadamente 100 a 500 l (aproximadamente 6-7 minutos) y descartar el filtrado.
14. Añadir 2 ml de TE Amicon filtro y centrifugar a 3500 g durante 6 minutos, asegurándose de usar una punta de pipeta para cada uno además de evitar la contaminación cruzada. Repita dos veces.
15. Concentrado a un volumen final de 50 a 100 l por centrifugación adicionales si es necesario y la transferencia de la solución de ADN en el filtro a un nuevo tubo Eppendorf de 1,5 ml.
16. Añadir 40 ml TE al filtro Amicon y una pipeta de arriba a abajo a lo largo de las dos membranas de filtro para lavar cualquier resto de ADN. Añadir esta solución en el tubo de 5,15.
17. Coloque una Microcon YM-30 unidad de filtro en un tubo de Microcon prelavado y el microcontrolador mediante la adición de 200 l agua esterilizada y centrifugar a 10.000 rpm durante 7 minutos.
18. Añadir la solución de ADN de 5,16 a la Microcon prelavado con el fin de concentrar aún más el ADN. Centrifugar a 5000-10000 g por 1 - 3 minutos. Compruebe la cantidad de líquidoel sistema de centrifugación de filtro y repetir hasta que la cantidad de líquido en el filtro se reduce a aproximadamente 50 microlitros.
19. Coloque la unidad del filtro boca abajo en un tubo de Microcon nuevas y centrifugar a 1000 g por 3 minutos. La cantidad ideal de la solución concentrada es de 50-60 l.
20. Medir y registrar la concentración del ADN en un Nanodrop y control de calidad del pico (deberían ser 260 nm).
21. Transferencia de una pequeña alícuota del ADN a un tubo eppendorf limpio para trabajar acciones y congelar a menos 20. Transferir el resto del ADN a un segundo eppendorf limpio y se congelan a menos 80.

Los resultados representativos:

Cuando este protocolo se realiza correctamente, debería ver una imagen de gel después del paso de 4,4 en la determinación de la calidad del ADN similar a la Figura 1. Concentración de ADN real de los extractos puede variar dependiendo de la fuente de la muestra. Después del paso de 5,7 centrifugación en gradiente de CsCl, el ADN genómico iluminado por la luz azul debe ser similar a la Figura 2.

Figura 1. Agarosa al 0,8% la imagen de electroforesis en gel de ADN de alto peso molecular recogidos en cuatro profundidades en el océano Pacífico subártico (por duplicado), se tiñeron con el agente intercalante bromuro de etidio (10 mg / ml). Gel se ha ejecutado a 15 V para ~ 16 horas en el amortiguador 1X TBE gel en funcionamiento. Las bandas de la muestra son de buena calidad que muestran poca evidencia de corte mecánico (solo muestra las bandas o manchas en lugar de múltiples bandas), si bien los extractos de 10 millones de retener parte del ARN llevan más (ver mancha en el rango de 0,5 a 2,0 Kb).

Figura 2. Banda de ADN genómico iluminado por la luz azul después de centrifugación en gradiente de CsCl.

Discussion

Dependiendo de cuántas muestras se van a procesar, esto puede ser un procedimiento que consumen mucho tiempo debido a los dos pasos de la incubación de una hora, y los lavados repetidos y pasos de centrifugación. Es mejor plan de dos días para este procedimiento para dejar un montón de tiempo. Si hay problemas para conseguir el volumen de extracto final en el tubo de Amicon para reducir hasta 200-500μl durante la concentración de ADN y el lavado, trate de hacer más lavados de TE y centrifugaciones (repetir la tercera parte) hasta que el volumen sea el adecuado sobrante. Además, si el extracto de cloroformo olores agudamente, lo mejor es hacer lavados, hasta que el olor disminuye para asegurarse de que todo el cloroformo se elimina. Una vez más, todos los reactivos utilizados en este protocolo que se distribuyan de las existencias de laboratorio que trabajan en pequeñas poblaciones-esto es muy importante para evitar la contaminación cruzada de muestras de ADN y la contaminación de las reservas de laboratorio. Además, al pipetear, asegúrese de cambiar las puntas de la pipeta para cada adición para evitar la contaminación cruzada.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 cc syringe (26G5/8 needle)	BD Biosciences	309597
1 ml syringe (26G5/8 needle)	BD Biosciences	309597
1.5ml eppendorf tubes	Eppendorf	0030 125.150
15ml tubes	Sigma-Aldrich	CLS430791
5cc syringe	BD Biosciences	309603
Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices	EMD Millipore	UFC801096	10,000 Nominal molecular weight limit
Butanol	Fisher Scientific	A383-1	Make it water saturated (butanol:water = 1:1)
Centrifuge rotor, JA5.3	Beckman Coulter Inc.	368690
Centrifuge, Avanti® J-E	Beckman Coulter Inc.	369003
Cesium chloride	Sigma-Aldrich	C4036
Chloroform:IAA (24:1)	Sigma-Aldrich	25666-500ML
Ethidium Bromide (EtBr)	Sigma-Aldrich	E1510-10ml
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma-Aldrich	E5134
Hybridization oven	Fisher Scientific	13-247-10	37°C & 55°C
Lysis Buffer			0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876-5G	125 mg in 1000 μl TE
Microcon® Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit	EMD Millipore	42410	50 bp cut off
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-10
Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1)	Sigma-Aldrich	77617-500ML
Proteinase K	Qiagen	19133
RNase A	Fisher Scientific	BP2539-100	10 μg/ml
Safe Imager™ Blue light transilluminator	Invitrogen	S37102
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L4509	20% SDS
Sterivex filters	Fisher Scientific	SVG010RS
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Table top centrifuge	Eppendorf	5415D
TE buffer, pH 8.0
Trizma® base	Sigma-Aldrich	T1503
Ultracentrifuge rotor, TLA 100	Beckman Coulter Inc.	343847
Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC)	Beckman Coulter Inc.	343775
Ultracentrifuge tube rack	Beckman Coulter Inc.	348302
Ultracentrifuge, Optima® Max	Beckman Coulter Inc.