وصف إجراء الفسفرة باستخدام كمية cryolysis ، solubilziation اليوريا ، وتجزيء HILIC تخصيب IMAC من الببتيدات فسفرته.
يصف هذا البروتوكول في نمو والتحفيز ، مع أوليئات الأحماض الدهنية ، الثقيلة والخفيفة isotopically خلايا خميرة س. هي الأرض الخلايا باستخدام إجراء cryolysis في كرة مطحنة مطحنة وgrindate الناتجة جلبت الى حل عن طريق solubilization اليوريا. هذا الإجراء يسمح للتحلل الخلايا في دولة غير نشطة عملية الأيض ، والحفاظ على الفسفرة ومنع إعادة توجيه phosphoproteome أثناء تحلل الخلية. بعد التخفيض ، ألكلة ، تربسين هضم البروتينات ، والمحلاة العينات على أعمدة C18 وتعقيد العينة بنسبة تجزئة باستخدام ماء التفاعل اللوني (HILIC). أعمدة HILIC الاحتفاظ تفضيلي الجزيئات المائية التي هي مناسبة تماما لphosphoproteomics. الببتيدات فسفرته تميل إلى أزل في وقت لاحق ملف الكروماتوغرافي من نظرائهم من غير فسفرته. بعد التجزيء ، وأثرى به phosphopeptides يجمد اللوني المعادن ، الذي يعتمد على المسؤول القائم على الانتماءات لتخصيب phosphopeptide. في نهاية هذا الإجراء العينات مستعدون ليتم تحليلها كميا بواسطة مطياف الكتلة.
وهذه الطريقة تؤدي الى تخصيب phosphopeptides التي يمكن تحليلها كميا. ويمكن تغيير عدد من المعلمات في هذا البروتوكول ، ولكن الجانب الأكثر أهمية هو أن نتذكر للحفاظ على الفسفرة الخاص. لا يمكن أن يتحقق إعداد الخلايا لالكمي في عدد من طرق مختلفة ، على سبيل المثال اذا كنت لا تستطيع تس…
نود أن نشكر الدكتور ريتش روجرز للحصول على المساعدة الفنية مع تحليلات ومناقشات مطياف الكتلة مفيدة ، والدكاترة. سرقة موريتز ، Ranish جيف ، وحميد Mirzai لإجراء مناقشات مفيدة.
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة ومراكز للتميز.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4 | Sigma-Aldrich | 608033 | ||
Isotec™ L-Lysine-15N2 | Sigma-Aldrich | 609021 | ||
GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid | Invitrogen | 70011044 | ||
SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | ||
Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78420 | ||
Retsch PM100 Ball Mill Grinder | Retsch | 20.540.0001 | ||
Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar | Retsch | 01.462.0148 | ||
Ultramicrospin C18 column | The Nest Group | SUM SS10 | ||
Sep-Pak Vac 500 mg C18 | Waters | WAT043395 | ||
TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column | TOSOH BioSciences | 13071 | This is the HILIC chromatographic column. | |
Guard column 4.6 mm ID x1 cm | TOSOH BioSciences | 19021 | We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column. | |
PHOS-Select™ Iron Affinity Gel | Sigma-Aldrich | P9740 | This is the IMAC resin. Aliquot and store. |