Контроль и анализ нейронных цепей<em> В естественных условиях</em> Способствовало бы технологию для доставки вирусов и других реагентов из 3-мерных наборов области мозга. Мы демонстрируем настроены жидкостный инжектор массив изготовление и доставку вирусно кодировке оптических сенсибилизаторов, что позволяет оптическое манипулирование комплексных схем мозга.
Наше понимание нейронные цепи, – как они посредником вычислений, которые subserve ощущения, мысли, эмоции и действия, и как они повреждены в неврологических и психических расстройств – будет в значительной мере способствовало технологии для быстрой ориентации гены комплекса 3 – мерных нейронных цепей, быстрого создания "сеансового уровня трансгенных". Мы недавно разработали методы, в которых вирусы кодировки для светочувствительных белков может внимания специфические типы клеток к миллисекунд сроки активации и глушителей в интактном мозге. Мы здесь присутствует разработке и реализации массива инжектор, способных доставлять вирусы (или другой жидкости) в десятки определенных точках в течение 3-мерной структуры головного мозга (<strong> Рисунок. 1А, 1Б</strong>). Массив инжектор содержит один или более объемные насосы, что каждый диск набор шприцов, каждый из которых питается в полиимида / из кварцевого стекла с помощью капиллярного высокого давления, устойчивых к разъему. Капилляры размера, а затем вставляется, желаемых местах, указанных на заказ фрезерные стереотаксической борту позиционирование, что позволяет вирусы или другие реагенты для доставки желаемый набор области мозга. Чтобы воспользоваться устройством, хирург сначала заполняет жидкостный подсистемы полностью с маслом, backfills капилляров с вирусом, вставляет устройство в мозг, и вселяет реагенты медленно (<0,1 мкл / мин). Параллельную природу массив инжектора способствует быстрой, точной и надежной маркировки целых нейронных цепей с вирусными полезных нагрузок, таких как оптические сенсибилизаторы включить свет активации и заставить замолчать определенных схем мозга. Наряду с другими технологиями, такими как оптические волокна массивов для легкой доставки искомые множества мозга регионов, мы надеемся создать инструментарий, который позволяет систематическое зондирование причинных функций мозга в интактном мозге. Эта технология может не только открыть такие системных подходов к схеме ориентированной неврологии у млекопитающих, а также содействовать маркировки области мозга в больших животных, таких как не-человеческое приматов, но также может открыть клинические поступательного путь для клеточной удельной оптической протезирование контроль , чья точность может дать улучшение лечения неразрешимыми расстройства мозга. Наконец, такие устройства, как описано здесь может способствовать именно своевременная доставка жидкостный другие полезные нагрузки, такие, как стволовые клетки и фармакологических агентов, до 3-мерной структуры, легко настраиваемых пользователем моды.
В последние годы число генетически закодированы оптических сенсибилизаторов позволили нейроны активируются и замолчать в естественных условиях в временно точностью моды, в ответ на короткие импульсы света (например, 1,4,5,6,7,8 , 11). Ключевым методом, с которой нейроны имели возможность ознакомиться с света в мозге млекопитающих, является использование вирусов, таких как лентивирусов и адено-ассоциированные вирусы (ААВ), которые могут доставить гены, кодирующие opsins в мозг животных от мышей до обезьян, в безопасной и прочной одежды (например, 2,9,10). Вирусы позволяют быстрее затрат времени, чем у трансгенных, особенно для организмов, которые не являются генетическими модельных организмов, таких как крысы и обезьяны, и для opsins может позволить высоким уровнем выражение, которое не может быть возможным в трансгенных сценариев. Здесь мы показываем, параллельный массив инжектор способен создать, в быстром сроки ", сеансового уровня трансгенных", позволяющие всем 3-мерной структуры мозга, чтобы быть с вирусно целевой ген, в одном хирургическом шаг. Массив инжектор содержит один или более объемные насосы, что каждый диск набор шприцов, каждый из которых питается в полиимида / из кварцевого стекла с помощью капиллярного высокого давления, устойчивых к разъему. Капилляры размера, а затем вставляется, желаемых местах, указанных на заказ фрезерные стереотаксической борту позиционирование, что позволяет вирусы или другие реагенты для доставки желаемый набор области мозга. Чтобы воспользоваться устройством, хирург сначала заполняет жидкостный подсистемы полностью с маслом, backfills капилляров с вирусом, вставляет устройство в мозг, и вселяет реагенты медленно (<0,1 мкл / мин).
Эта технология позволит широкий спектр новых видов экспериментов, таких, как миллисекунд сроки закрытия сложно форме структуры (например, гиппокамп) в конкретное время поведение, временно точностью инактивации двусторонних структур, которые могут выступать в избыточно (например, левой и правой миндалины), и возмущение нескольких дискретных областях мозга (например, вождение двух соединенных между регионами по фазе, чтобы изучить, как кросс-регион синхронность зависит от деятельности в рамках каждого региона, или стимулирующие вклад в регионе в то время как глушителей подмножество цели, чтобы понять, какая из нескольких целей имеют решающее значение для посреднической последствия этих входов). Для больших мозгов как и на приматах, в котором мы недавно продемонстрировала оптический камерного типа конкретной нейронной активации 3, возмущающих деятельности в поведенчески-соответствующей области могут потребовать вирусной маркировки больших, сложных структур. Отметим, что параллельно массивы инжектор может быть использована для введения практически любую полезную нагрузку – лекарства, нейромодуляторов, нейромедиаторов, или даже клетки – в сложных 3-D модели в головном мозге, в временно-точно. Наконец, из поступательных точки зрения, вполне возможно, что быстрое, пациент настраиваемые генной терапии или устройств доставки лекарственных средств может быть быстро специально разработаны и изготовлены в соответствии с индивидуальными геометрии мозга, поддерживая новые методы лечения различных патологий, возможно за счет использования оптические молекул контроля.
Инжектор массивы предназначены, чтобы быть точным, как в пространстве и объемно. В X-и Y-направлений, это достигается путем бурения очень точно размещены отверстия с использованием недорогих мини-мельницы, с отверстиями достаточно большой, чтобы соответствовать инжекторов, так что инжекторы проходят параллельно друг другу, а в точном местоположения. В Z-направлении, инжекторы отделаны использованием стереотаксической аппарат, позволяющий уровень точности эквивалентна стереотаксической сама операция. Объемной точности возникает из-за точность насоса Гамильтона, а также почти нулевым мертвым объемом разъемов, адаптированных с высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) области. Инжекторы изготавливаются из плавленого кварца капиллярная трубка, которая является сильным и достаточно жестким, что он поддерживает точную форму и расстояние под давлением, не больше толщины стенки альтернативы, такие как сталь канюль. Малые изменения могут быть легко приняты для приведения параллельных массива инжектор для различных экспериментов. Например, если меньший объем вируса или меньшими интервалами не требуется, меньше капиллярной трубки могут быть использованы, наряду с соответствующим меньше сверло. Будущие устройства могут использовать микрожидкостных каналов и насосов, для увеличения числа параллельных инжекторы, чтобы свести к минимуму размеры (возможно, позволяющих такие устройства для установки на головы свободно движущихся животных).
The authors have nothing to disclose.
ESB признает, финансирование новых Новатор NIH директора премии (DP2 OD002002-01), NIH вызов Грант 1RC1MH088182-01, NIH Гранд Возможности Грант 1RC2DE020919-01, NIH 1R01NS067199-01, NSF (0835878 и 0848804), Макговерн института нейротехнологии премии программе , Министерство обороны, NARSAD, Альфреда П. Слоуна, Джерри и Мардж Бернетт, премии SFN исследований для инноваций в области неврологии, MIT Media Lab, Benesse Фонда, и Уоллес H. Coulter Foundation.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Dremel Tool | Tool | Dremel | 3956-02 | |
Laser Cutter | Tool | Universal Laser Systems | VLS2.30 | |
Hot glue gun | Tool | Stanley Bostitch | GR20 | |
Injection/withdrawal syringe pump (Hamilton pump) | Tool | Harvard Apparatus | 702001 | |
10 μl Hamilton syringes | Tool | Hamilton Company | 701N | Need one per injection site |
Mouse stereotax | Tool | Stoelting | 51725D | |
Modela mini-mill | Tool | Roland | MDX-15 | |
0.011″ diameter drill bit for mini mill | Tool | Mcmaster-Carr | 8915A12 | |
1/32″ diameter drill bit For mini-mill | Tool | McMaster-Carr | 8848A35 | |
High speed dental drill | Tool | Lynx | 333 | |
Dental drill accessories | Tool | Pearson | F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38 |
|
1.5mm outer diameter (OD) stainless steel cannula | Material | Small-Parts | HTX-15R | |
1-72 binding slotted machine screw | Material | Small-Parts | MX-0172B | |
1-72 hex nut | Material | Small-Parts | HNX-0172 | |
PCB proto-board, 1/32″ thick | Material | Digi-Key | PC57-T-ND | |
Acrylic Sheet, 1/8″ thick | Material | Mcmaster-Carr | 8560K239 | |
HPLC connectors | Material | Upchurch Scientific | F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (some of these can be bought in 10-packs; simply add an ‘x’ to the end of the part number) | Need one per injection per site, except F-252, P-627, and P-235, which can be reused |
Fused silica capillary tubing, OD: 245 μm, ID: 100 μm | Material | Polymicro Technologies | 2000022-10M | |
5-minute general purpose epoxy | Material | Permatex | 84101 | 5-minute general purpose epoxy |
Polyethylene tubing .066 x .095 inch | Material | VWR | 63018-827 |