에 대한 Mesoscopic 형광 Tomography 인 - 생체내 이미징 Drosophila Published: August 20, 2009 doi: 10.3791/1510

DOI

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Claudio Vinegoni¹, Daniel Razansky², Chrysoula Pitsouli³, Norbert Perrimon³, Vasilis Ntziachristos², Ralph Weissleder¹

¹Center for Systems Biology, Massachusetts General Hospital, ²Institute for Biological and Medical Imaging (IBMI), Technical University of Munich and Helmholtz Center Munich, ³Department of Genetics, Harvard Medical School and Howard Hughes Medical Institute

Summary

Mesoscopic 형광 tomography는 조직 sectioning 형광 현미경의 침투 제한없는 운영하고 있습니다. 이 기술은 다중 투영 조명 및 광자 수송 설명을 기반으로합니다. 우리의 morphogenesis의 인 - 생체내 전체 - 몸 3D 시각화 GFP - 표현에 날개 imaginal 디스크를 입증

Abstract

개발 기관 형성뿐만 아니라 질병의 progession 및 치료를 떠올리면 자주 많이 광학 그대로 살아있는 생물의 분자 및 기능적 변화를 심문할 수있는 능력에 의존합니다. 대부분의 기존 광학 이미징 방법은 현대적인 광학 현미경의 침투 한계 (0.5 - 1mm)과 광학 macroscopy의 확산 부과 한계 사이의 거짓말 차원에서 영상에 대한 불충 분한 아르 (> 1cm) [1]. 따라서, 많은 중요한 모델 생물은, 예를 들어 곤충, 동물 배아 또는 작은 동물 사지는, - 생체내 광학 이미징을 위해 액세스할 남아있다.

나노미터 해상도 광학 영상 방법의 개발에 대한 관심이 증가하고 있지만, 이미징 침투 깊이를 향상 많은 성공적인 노력이되지 않았습니다. 현미경 제한 이외에 - 생체내 이미징을 수행하는 능력은 조직에있는 광자 산란과 관련된 어려움을 만난 사실이다. 예를 들어, 이미지를 전체 배아 최근 활동 [2,3] 비산에서 선택을 취소 시편의 특수 화학 처리, 오직 사후 영상을 위해 적합하게 절차를 필요로합니다. 이 방법은 그러나 일반적으로 특히 발달 생물학 및 약물 발견의 두 광자 또는 공촛점 현미경에 의해 허용하는 것보다 큰 이미지 표본에 대한 필요성을 증거.

우리는 Mesoscopic 형광 Tomography라는 새로운 광학 이미징 기술을 개발 [4], 1mm - 5mm의 크기에 비침습에서 - 생체내 이미징에 적합한하는. 침투 깊이에 대한 메소드 교환 해상도지만,이 전례없는 단층 이미징 성능을 제공하며, 그것은의 형광 - 진화 이미지 수있는 능력을 imparting하여 발달 생물 관찰에 새로운 차원의 (그리고 생물 학적 연구의 가능성이 다른 영역)로 시간을 추가 개발되었습니다 시간이 지남에 따라 응답을 태그. 따라서 그것은 유전자 변이 또는 외부 자극에 대한 형태학의 또는 기능 종속성의 연구를 가속 수 있으며, 중요한 것은 같은 개발 유기체의 길이 시간 저속 시각화함으로써 개발 또는 조직 기능의 전체 사진을 캡처할 수 있습니다.

기술은 수정된 실험실 현미경 및 멀티 프로젝션은 조명 360도 계획에서 데이터를 수집을 활용합니다. 그것은 mesoscopic 범위에 적합한 현실 반전 체계를 구축하기 위해 기하학적 광학 원칙과 결합 광자 수송 방정식의 Fokker - 플랭크 솔루션에 페르미의 단순화를 적용합니다. 이것은 크기가 몇 mm에 샘플이 아닌 투명한 입체 구조에 - 생체내 전체 - 바디 시각화를 수 있습니다.

우리는 영상 입체적으로 기술의 인 - 생체내 성능을 보여준 - 생체내에서 연속으로 여섯 시간 동안 실시간으로 불투명 Drosophila pupae에있는 날개의 morphogenesis에 따라 Drosophila 조직 개발을 구조.

Protocol

본 실험에 사용된 Drosophila melanogaster의 주식은 다음과 같습니다

• elav - Gal4 (FBti0002575)
• AP - Gal4md544 (FBal0051787)
• UAS - srcEGFP (FBti0013990)
• w1118 (FBal0018186)

모든 실험은 UAS - Gal4 시스템은 관심의 조직 (즉 침샘이나 날개 디스크)에 overexpress GFP로 사용되었습니다. 보다 구체적으로, 적절한 Gal4와 유전자 변형 여성 파리는 UAS - EGFP 형질 전환 메이트로 교차했다. 십자가는 humidified 인큐베이터에서 25 ° C에서 reared했다. pupae가 튜브를 (약 5-6일 십자가의 개시 후) 채우기 시작할 때, 그들은 흰색 prepupal 단계 (번데기 형성 후 0-1 시간)에서 GFP 형광을 위해 선택하고 tomography 이미징에 대한 수집했다.

1. 25 적절한 교차하고 후방을 설정 ° C
2. 5~6일 십자가의 개시 후 이미지에 대한 형광 자손을 선택합니다. 유리병의 측면에서 흰색 prepupae의 부드러운 제거 젖은 페인트를 사용하십시오.
3. 물 또는 PBS의 드롭 prepupae을 넣어 음식 입자 및 pupal 사건을 커버하고 표본이 autofluorescent 만드는 접착제를 제거하기 위해 페트리 접시에 위치. 페인트 브러쉬로 부드럽게 닦아주십시오. pupae의 고령화가 필요한 경우 장소는 젖은 종이 타월 (습기 챔버) 또는 비행 음식 깨끗한 유리병의 측면에서 배양 접시에있는 흰색 prepupae을 선택했습니다. 이것은 동물의 적절한 개발을 허용하기 위해 충분한 습도가 있는지 확인합니다.

Drosophila 장착

1. 글루 모세관 유리관 (800 미크론 직경)에 pupal 케이스의 하단 부분 파리의 후부 / 앞쪽에 축은 튜브에 평행 방향입니다 같은.
2. 회전 무대에서 수직으로 모세관을 수정.
3. 이미징 CCD의 픽셀 컬럼에 평행으로 회전 축에 대한 순서로 회전 무대의 틸팅 축을 조정합니다.

결정 전달 모델

1. 모세관 유리에 번데기를 수정하고 이전에 설명된대로 마운트
2. 형광 염료 (Cy5.5)와 실리카 모세관 (100 미크론, OD)를 작성
3. 후부 / 앞쪽에 축에 대하여 45도에서 번데기 내부의 모세관 튜브를 삽입
4. 낮은 수치 조리개 렌즈 여기 레이저 빔을 번데기를 조명. 의 수직 축을 따라 번데기를 회전 360도 이상의 형광 transillumination 이미지를 수집합니다.
5. 적절한 앞​​으로 모델과 실험 데이터를 맞추기

이미징 침샘

1. 로 언급한 침샘에서 번데기 표현 GFP 마운트
2. 여기 빔과 함께 조명하고 transillumination 년에 세로 축을 따라 번데기를 회전 360도 이상의 GFP의 형광 신호를 수집합니다.
3. 앞으로 모델을 이용하여 획득한 데이터를 재구성

시간 경과 이미징

1. 날개 imaginal 디스크에 흰색 prepupa 표현 GFP 마운트
2. 번데기의 탈수를 피하기 위해 이미징 환경을 습기와 실온에서 보관.
3. 지속적인 조명을 피하기 위해 셔터를 배치
4. 여기 빔과 함께 조명하고 transillumination 년에 세로 축을 따라 번데기를 회전 360도 이상의 GFP의 형광 신호를 수집합니다.
5. 앞으로 모델을 이용하여 획득한 데이터를 재구성.

조직학

1. 1X PBS의 침샘의 CNS / 눈 디스크를 해부하다.
2. 4 % 포름 알데히드, 실온에서 20 분 대한 1X PEM (100mM 파이프, 1mM EGTA, 1mM MgCl ₂₎ 조직을 수정.
3. dapi (벡터)로 Vectashield에 고정하고 마운트를 제거
4. 형광 현미경으로 이미지.

시간 경과 조직학

1. 흰색 prepupae를 수집하고 습기가 실내에서 그들을 무대.
2. 다른 발달 단계에서 pupae 수집
3. 비열한 고정하기 전에 좋은 바늘 (곤충 핀 000, FST)를 두 번 pupal 케이스 (번데기 형성 후 0 시간).
4. 부드러운 교반과 함께 실온에서 6-8 시간 8 %의 포름 알데히드, 1X PEM에서 pupae을 수정.
5. 고정의 제거 및 1X PBS로 rinsing이 두 가지에 날카로운 칼날과 고정 번데기를 잘라 후 A / P의 축에 직각;
6. 잠수함 이미징을위한 coverglass 슬라이드에 dapi (벡터)와 마운트와 Vectashield의 ​​두 조각 (랩 - 테크).
7. 형광 공촛점 현미경으로 이미지를 획득.

그림 1. 주시기 바랍니다 여기를 클릭하십시오 알을 볼그림 1의 arger 버전.

Discussion

pupal 가지 경우에 - 생체내의 reconstructions 및 D.의 GFP - 표현 침샘 해당 조직학 (블루, dapi의 얼룩, 녹색, GFP 형광)로 melanogaster prepupa (스케일 바, 500 미크론)은 (A) 그림 1에 표시됩니다. D.의 시간 경과 시리즈 이미지 melanogaster 날개 imaginal 디스크는 Fig.1 (B)에 표시됩니다. 이미지는 네 가지 시간 포인트 (0,3.0, 3.5, 및 6.5 시간)에서 한 라이브 표본에서 얻은 수 있습니다. 번데기의 등 부분의 전망에 대해서는 0도에서 첫 번째 열 한 투영에 표시됩니다. 두 번째 열에있는 reconstructions은 붉은 선으로 표시된 부분에 해당한다. 마지막으로, 조직학와 비교 세 번째 열을 표시됩니다. 분명히, histological 준비는 단층 reconstructions과 잘 상관 관계. Drosophila의 pupal 케이스와 GFP - 표현 침샘의 (C) 평면 이미지에.