Summary
Мезоскопические флуоресценции томографии работает за пределы проникновения ткани срезов флуоресцентной микроскопии. Методика основана на мульти-проекции освещением и фотонной описание транспорта. Мы демонстрируем в естественных условиях всего тела 3D визуализация морфогенеза GFP-экспрессирующих крыло имагинальных дисков
Protocol
Дрозофилы запасы, используемые в данном эксперименте являются следующие:
- elav-Gal4 (FBti0002575)
- AP-Gal4md544 (FBal0051787)
- UAS-srcEGFP (FBti0013990)
- w1118 (FBal0018186)
Для всех экспериментов, UAS-Gal4 система была использована для гиперэкспрессией GFP в ткани интерес (т.е. слюнных желез или крыло диски). В частности, самок трансгенных с соответствующим Gal4 были скрещены на UAS-EGFP трансгенных товарищей. Крестов было выращено при 25 ° С в увлажненной инкубатора. Когда куколки начать заполнение флаконах (примерно 5-6 дней после начала крест), они были отобраны для GFP флуоресценции при белом prepupal этапе (0-1 ч после формирования пупария) и собранных для томографии.
- Настройка соответствующие кресты и задних при 25 ° С
- 5-6 дней после начала крест, выберите флуоресцентные потомства для работы с изображениями. Использование мокрой кистью для нежного удаления белого предкуколок из сторон флаконе.
- Положите предкуколок в капле воды или PBS размещены в чашке Петри, чтобы удалить частицы пищи и клей, который охватывает куколки дело и делает образца autofluorescent. Аккуратно очистите кисть. Если старение куколки необходимо, место, выбранное белый предкуколок в чашку Петри с мокрым бумажным полотенцем (влажной камере), либо по бокам чистый флакон с летучей пищи. Это будет гарантировать, что есть достаточно влаги, чтобы обеспечить правильное развитие животного.
Монтаж дрозофилы
- Клей нижней части куколки случае в капиллярной стеклянной трубки (800 микрон в диаметре), что передняя / задняя ось мухи ориентирована параллельно трубе.
- Fix капиллярной трубке вертикально на ротационной стадии.
- Отрегулируйте наклон оси вращательное этапе для того, чтобы оси вращения должны быть параллельны пикселей колонны изображения CCD.
Модель определения Вперед
- Fix куколки в капиллярной стеклянной и смонтировать, как описано выше
- Заполните кварцевую капиллярную трубку (100 микрон, О. Д.) с флуоресцентным красителем (Cy5.5)
- Вставьте капилляр внутри куколки при температуре 45 градусов по отношению к передней / задней оси
- Illuminate куколки с пучком лазерного возбуждения с низкой числовой апертуры линзы. Сбор флуоресцентные изображения просвечивание более 360 градусов вращающийся куколки вдоль его вертикальной оси.
- Fit экспериментальных данных с соответствующими вперед модель
Изображений слюнных желез
- Горы куколки выражения GFP в слюнных железах, как описано выше
- Illuminate с возбуждением пучка и собирать в просвечивание сигнала флуоресценции GFP более 360 градусов вращающийся куколки вдоль его вертикальной оси.
- Реконструкция приобретенных данных с использованием передовых моделей
Time-Lapse изображений
- Горы белых prepupa выражения GFP в крыле имагинальных дисков
- Держите изображений среды влажных и при комнатной температуре, чтобы избежать обезвоживания куколки.
- Место выдержки, чтобы избежать непрерывного освещения
- Illuminate с возбуждением пучка и собирать в просвечивание сигнала флуоресценции GFP более 360 градусов вращающийся куколки вдоль его вертикальной оси.
- Реконструкция приобретенных данных с использованием модели вперед.
Гистология
- Рассеките слюнных желез ЦНС / глаз диски 1x PBS.
- Fix тканей в 4% формальдегида, 1x PEM (100 мм трубы, 1мМ EGTA, 1мМ MgCl 2) для 20 минут при комнатной температуре.
- Удалить фиксации и установки в Vectashield с DAPI (вектор)
- Изображение с флуоресцентным микроскопом.
Time-Lapse Гистология
- Сбор белых предкуколок и стадии их во влажной камере.
- Сбор куколки на разных стадиях развития
- Укол куколки случае в два раза (0 часов после Пупарий свита) с помощью тонкой иглы (насекомое контактный 000, ФСТ) до фиксации.
- Fix куколки в 8% формальдегида, 1x PEM в течение 6-8 часов при комнатной температуре при легком помешивании.
- После снятия фиксации и промывки 1x PBS, вырезать фиксированной куколки с острым лезвием на две части перпендикулярно оси / P;
- Погрузите две штуки в Vectashield с DAPI (вектор) и смонтировать на покровного стекла слайдов (Lab-Tek) для работы с изображениями.
- Получение изображений с флуоресценции конфокальной микроскопии.
Рисунок 1. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы увидеть др.arger версия рисунке 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В естественных условиях реконструкции куколки дела и GFP-экспрессирующих слюнных желез D. MELANOGASTER prepupa (Масштаб бар, 500 мкм) с соответствующими гистологии (синий, DAPI окрашивания; зеленый, GFP флуоресценции) показана на рис 1 (а). Покадровый серии изображений D. MELANOGASTER крыло имагинальных дисков показана на рис.1 (б). Изображения, приобретенные у одного живого образца, на четырех различных моментов времени (0,3.0, 3,5 и 6,5 часа). В первой колонке одной проекции при 0 градусов по отношению к спинной куколки является показано на рисунке. Во второй колонке реконструкции соответствуют разделам указывается красными линиями. Наконец, по сравнению с гистологии показано третьей колонке. Очевидно, гистологических препаратах хорошо коррелируют с томографической реконструкции. В (в) плоские образе куколки случае дрозофилы и GFP-экспрессирующих слюнных желез.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
С. Vinegoni признает поддержке Национального института здоровья (NIH) предоставлять 1-RO1-EB006432.
References
- Ntziachristos, V. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
- J, Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Dodt, H. U. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).
- Vinegoni, C. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Nat. Methods. 5, 45-47 (2008).