Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila Published: August 20, 2009 doi: 10.3791/1510
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 2, 1
1Center for Systems Biology, Massachusetts General Hospital, 2Institute for Biological and Medical Imaging (IBMI), Technical University of Munich and Helmholtz Center Munich, 3Department of Genetics, Harvard Medical School and Howard Hughes Medical Institute

Summary

Mezoskopik floresan tomografi doku kesit floresan mikroskopi penetrasyon sınırları ötesinde faaliyet göstermektedir. Tekniği çok projeksiyon aydınlatma ve foton bir taşıma açıklamasına dayanmaktadır. Biz, in vivo morfolojilerinden tüm vücut 3B görselleştirme, GFP ifade kanat hayali diskler göstermektedir

Abstract

Gelişen organ oluşumu yanı sıra hastalık ve tedavi progession görselleştirme genellikle ağır optik bozulmadan yaşayan organizmaların moleküler ve fonksiyonel değişiklikler sorgulamak için yeteneği üzerine dayanır. En mevcut optik görüntüleme yöntemleri, modern optik mikroskop penetrasyon sınırları (0.5-1mm) ve optik makroskopi difüzyon dayatılan sınırları arasında yer alan boyutlarda görüntüleme için yeterli (> 1cm) [1]. Böylece, çok önemli bir model organizmalar, örneğin böcekler, hayvan embriyolar ya da küçük hayvan ekstremitelerde, in vivo optik görüntüleme için ulaşılmaz kalır.

Nanometre çözünürlüklü optik görüntüleme yöntemlerinin geliştirilmesi yönünde ilgi var artmasına rağmen, birçok başarılı görüntüleme penetrasyon derinliği iyileştirilmesi çabaları olmamış. Mikroskopi sınırlarının ötesinde in vivo görüntüleme gerçekleştirmek için yeteneği dokularda bulunan foton saçılması ile ilgili zorluklar ile bir araya geldi aslında. Örneğin görüntü tüm embriyolar son çabaları [2,3] saçılma onları temizlemek için numunenin özel kimyasal arıtma, sadece post-mortem görüntüleme için uygun bir prosedür gerektirir. Bu yöntemler ancak görüntüleme büyük örnekler için: genellikle iki-foton veya konfokal mikroskopi, özellikle gelişim biyolojisi ve ilaç keşfi tarafından izin olanlardan daha kanıtlar.

Biz mezoskopik Floresans Tomografi adlı yeni bir optik görüntüleme tekniği geliştirdi [4], 1mm-5mm boyutlar non-invaziv in vivo görüntüleme için uygun. Penetrasyon derinliği yöntemi değişim çözünürlük, ama eşi görülmemiş bir tomografik görüntüleme performansı sunar ve floresan evrim görüntü yeteneği aktararak gelişimsel biyoloji gözlemler (ve muhtemelen diğer biyolojik araştırma alanlarında) olarak yeni bir boyut eklemek için geliştirilmiştir zamanla yanıtları etiketli. Gibi gen mutasyonları ya da dış uyaranlara morfolojik veya fonksiyonel bağımlılıkları çalışmaları hızlandırmak ve önemlisi, aynı, gelişmekte olan organizmanın uzunlamasına zaman atlamalı görselleştirme izin vererek geliştirme veya doku işlevini tam bir resim çekebilirsiniz.

Bu teknik, modifiye edilmiş bir laboratuvarda mikroskop ve 360 ​​derece projeksiyonları veri toplamak için çok projeksiyon aydınlatma kullanır. Mezoskopik aralığı için uygun gerçekçi bir inversiyon şeması oluşturmak amacıyla geometrik optik ilkeleri ile birlikte Fokker-Plank foton transport denkleminin çözümü, Fermi basitleştirilmesi geçerlidir. Bu büyüklüğü birkaç milimetre örneklerinde şeffaf olmayan üç boyutlu yapıları, in-vivo tüm vücut görselleştirme kadar izin verir.

In-vivo ve Drosophila dokular, gerçek zamanlı olarak altı saatten fazla üst üste opak Drosophila pupa kanat morfolojilerinden takip ederek gelişmekte olan yapıları görüntüleme üç boyutlu tekniğin in vivo performans göstermiştir.

Protocol

Bu deneyde kullanılan Drosophila melanogaster hisse senetleri aşağıdaki gibidir:

  • elav Gal4 (FBti0002575)
  • ap Gal4md544 (FBal0051787)
  • UAS srcEGFP (FBti0013990)
  • w1118 (FBal0018186)

Tüm deneyler için, ilgi doku (yani tükürük bezleri veya kanat diskler) eksprese GFP UAS Gal4 sistemi kullanıldı. Daha spesifik olarak, uygun Gal4 transgenik erkek sineklerin UAS EGFP transgenik arkadaşları geçti. Haçlar nemlendirilmiş bir kuvöz, 25 ° C sıcaklıkta yetiştirilen idi. Pupa (çapraz başladıktan sonra yaklaşık 5-6 gün) şişeleri doldurma başlattığınızda, GFP floresan beyaz prepupal sahne (puparium oluşumundan sonra 0-1 saat) seçilmiş ve tomografi görüntüleme için toplanmıştır.

  1. Set up uygun haçlar ve arka 25 ° C
  2. Çapraz başlandıktan 5-6 gün sonra, görüntüleme için floresan döl seçin. Flakonun taraftan beyaz prepupae yumuşak kaldırılması için ıslak bir fırça kullanın.
  3. Gıda parçacıkları ve pupa halinde kapsar ve örnek autofluorescent yapar tutkal kaldırmak için bir petri kabına yerleştirilir, su ya da PBS bir damla prepupae koyun. Yavaşça bir fırça ile temizleyin. Pupa yaşlanmasını gerekli ise, yerde, ıslak bir kağıt havlu (nemli odasının) ya da bir sinek gıda ile temiz bir flakon iki petri beyaz prepupae. Bu hayvanın uygun şekilde gelişimi sağlamak için, yeterli nem var olmasını sağlayacaktır.

Drosophila Montaj

  1. Tutkal, kapiller cam tüp (800 mikron çaplı) içine pupa halinde alt kısmında sinek anterior / posterior eksen tüp paralel odaklı olduğu gibi.
  2. Dönme aşamasında dikey kılcal tüp sabitleyin.
  3. Görüntüleme CCD piksel sütunları paralel olarak dönme ekseni için dönme aşamasının devirme ekseni ayarlayın.

Belirlenmesi İleri Modeli

  1. Kılcal bir cam bir pupa saptamak ve yukarıda açıklandığı gibi monte
  2. (Cy5.5) floresan boya ile silika kapiler tüp (100 mikron, OD) doldurun
  3. Anterior / posterior eksenine göre 45 derece sıcaklıkta pupa içindeki kılcal tüp takın.
  4. Pupa, düşük bir sayısal diyafram ile bir ikaz lazer ışını ile aydınlatın. 360 derecenin üzerinde dikey eksen boyunca pupa dönen floresan transillüminasyon görüntüleri toplayın.
  5. Uygun bir ileri modeli ile deneysel veriler Fit

Görüntüleme Tükrük Bezleri

  1. Önce açıklandığı gibi tükürük bezlerinde Mount pupa ifade GFP
  2. Bir uyarma ışını ile aydınlatın ve transillüminasyon pupa dikey ekseninde 360 ​​derece dönen üzerinden GFP floresan sinyal toplamak.
  3. Elde edilen veriler ileri modeli kullanılarak yeniden

Zaman Aşımı Görüntüleme

  1. Kanat hayali diskler Mount beyaz prepupa ifade GFP
  2. Pupa dehidratasyonu önlemek için görüntüleme ortamı nemli ve oda sıcaklığında tutun.
  3. Sürekli aydınlatma önlemek için bir deklanşör yerleştirin.
  4. Bir uyarma ışını ile aydınlatın ve transillüminasyon pupa dikey ekseninde 360 ​​derece dönen üzerinden GFP floresan sinyal toplamak.
  5. Yeniden ileri bir model kullanılarak elde edilen veriler.

Histoloji

  1. 1x PBS tükürük bezleri CNS / göz diskleri ayır.
  2. % 4 formaldehit, oda sıcaklığında 20 dk 1x PEM (100 mM Borular, 1mm EGTA, 1mm MgCl 2) doku sabitleyin.
  3. DAPI (vektör) ile Vectashield fiksasyonu ve bağlama çıkarın
  4. Floresan mikroskobu ile görüntüsü.

Zaman Aşımı Histoloji

  1. Beyaz prepupae toplayın ve nemli bir odasında aşamasında.
  2. Farklı gelişim aşamalarında pupa toplayın
  3. Prick fiksasyon (böcek pin 000, FST) önce ince bir iğne ile iki kez pupa halinde (Puparium Oluşumu sonra 0 saat).
  4. Yavaşça sallanarak oda sıcaklığında 6-8 saat,% 8 Formaldehit, 1x PEM pupa sabitleyin.
  5. Fiksasyon 1x PBS ile durulama kaldırma ve keskin bir bıçak, iki adet sabit pupa kesip sonra A / P eksene dik;
  6. Batmak görüntüleme için coverglass kızaklar üzerinde DAPI (Vektör) ve mount Vectashield iki adet (Lab-Tek).
  7. Bir floresan konfokal mikroskop ile görüntüler elde.

Şekil 1
Şekil 1: Lütfen buraya tıklayın al .Şekil 1 arger sürümü.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In vivo rekonstrüksiyonlar ve pupa halinde D. GFP ifade tükürük bezleri (mavi, DAPI boyanması, yeşil, GFP floresan) ile ilgili histoloji melanogaster prepupa (Ölçek bar, 500 mikron) (a) Şekil 1 de gösterilmiştir. D. Time-lapse serisi görüntüleme melanogaster kanat hayali diskler Şekil 1 (b) 'de gösterilmiştir. Görüntüleri dört farklı zaman noktalarında (0,3.0, 3.5, ve 6.5 saat), tek bir canlı örnek elde edilir. 0 derece pupa dorsal görünümüne ilişkin ilk sütunda bir projeksiyon olarak gösterilmiştir. İkinci sütunda rekonstrüksiyonlar kırmızı çizgiler belirtilen bölümlere karşılık gelir. Son olarak, histoloji ile bir karşılaştırma, üçüncü sütunda gösterilir. Açıkçası, histolojik hazırlıkları tomografi rekonstrüksiyonları ile ilişkilidir. (C) bir Drosophila'nın pupa halinde ve GFP-ifade tükürük bezleri düzlemsel görüntü.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

C. Vinegoni Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibe 1-RO1-EB006432 desteği kabul eder.

References

  1. Ntziachristos, V. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
  2. J, Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
  3. Dodt, H. U. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).
  4. Vinegoni, C. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Nat. Methods. 5, 45-47 (2008).

Tags

Gelişimsel Biyoloji Sayı 30 floresan tomografi mezoskopik görüntüleme Drosophila optik görüntüleme difüzyon tomografi saçılma
Mezoskopik Floresans Tomografi için<em> In-vivo</em> Görüntüleme Geliştirme<em> Drosophila</em
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Vinegoni, C., Razansky, D.,… More

Vinegoni, C., Razansky, D., Pitsouli, C., Perrimon, N., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila. J. Vis. Exp. (30), e1510, doi:10.3791/1510 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter