चूहा लेंस epithelia के मध्य क्षेत्र के Explants synchronously अंतर जब FGF-2 की उपस्थिति में संवर्धित. ऐसी संस्कृतियों के immunofluorescence माइक्रोस्कोपी उपन्यास जीन अभिव्यक्ति और संकेत टर्मिनल भेदभाव के साथ जुड़े घटनाओं के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं.
नेत्र लेंस के पूर्वकाल सतह उपकला कोशिकाओं है, जो एक कुंडलाकार सिलिअरी शरीर अंतर्निहित क्षेत्र में पैदा की एक monolayer द्वारा कवर किया जाता है. विभाजन के बाद, इन कोशिकाओं को पीछे विस्थापित, जहां रेटिना से diffusing FGF उन्हें लम्बी लेंस फाइबर कोशिकाओं है, जो लेंस की थोक की रचना के पीछे सरणी में अंतर लाती है. लेंस तंतुओं में लेंस उपकला कोशिकाओं के भेदभाव FGF-2 की उपस्थिति में पूर्वकाल उपकला के मध्य क्षेत्र के संवर्धन explants द्वारा इन विट्रो में प्रेरित किया जा सकता है. Explants नवजात चूहों के लेंस से आँख से लेंस को हटाने और विदारक चिमटी के साथ पीछे की ओर पर लेंस कैप्सूल लोभी द्वारा तैयार कर रहे हैं. पीछे कैप्सूल फिर धीरे से खुला फाड़ा और एक टिशू कल्चर पकवान की प्लास्टिक नीचे में नीचे दबाया. explant के परिधीय क्षेत्रों में एक स्केलपेल के साथ हटा रहे हैं और केंद्रीय क्षेत्र तो 100ng/ml FGF-2 के रूप में लंबे समय के रूप में 2-3 सप्ताह के लिए की उपस्थिति में संवर्धित है, अध्ययन किया जा मापदंडों पर निर्भर करता है. चूंकि सुसंस्कृत explants में उपकला कोशिकाओं सप्ताह के लिए दिनों की अवधि में लगभग synchrony में अंतर, संकेतन और जीन अभिव्यक्ति के समय कोर्स आणविक, जैव रासायनिक और औषधीय तकनीक का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है है. Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी इन तरीकों के लिए एक शक्तिशाली सहायक के रूप में यह ब्याज की प्रोटीन का subcellular स्थानीयकरण दर्शाता है और संकेत दे रास्ते के प्रयोगात्मक अभिव्यक्ती की शारीरिक परिणाम प्रकट कर सकते हैं.
चूहे लेंस explant सिस्टम सफलतापूर्वक किया गया है प्रयोगशालाओं की संख्या के लेंस 21,3,4,5 फाइबर लेंस उपकला कोशिकाओं के टर्मिनल भेदभाव अध्ययन के द्वारा प्रयोग किया जाता है. 100ng/ml पर FGF-2 को उजागर explants 6 मिनट के भीतर संकेतन में परिवर्तन दिखाने के morphology और जीन अभिव्यक्ति कई 3,4,5 दिनों में क्रमिक रूप से दिखने में परिवर्तन के साथ शुरू हो जाएगा. संस्कृतियों 2-3 हफ्तों के लिए व्यवहार्य रहते अगर देखभाल करने के लिए संक्रमण को रोकने के लिए लिया जाता है.
इस प्रोटोकॉल में वर्णित केंद्रीय explants भेदभाव के साथ जुड़े घटनाओं के अनुक्रम के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं, के बाद से वे कुछ होते हैं अगर किसी भी कोशिकाओं है कि FGF-2 से पहले भेदभाव मार्करों व्यक्त 1,5 जोड़ा जाता है. कोशिकाओं तो अंतर synchronously, एक पलटन के रूप में, संकेतन और transcriptional भेदभाव के साथ जुड़े घटनाओं के समय के पाठ्यक्रम का पालन करने के लिए यह संभव बना. समय के विभिन्न लंबाई के लिए संवर्धन explants इस प्रकार अनुक्रम घटनाओं के बारे में सटीक लौकिक जानकारी प्रदान करता है. विशिष्ट inhibitors संस्कृति के माध्यम से जोड़ा जा सकता है के लिए प्रासंगिक संकेत दे रास्ते की पहचान हैं. Explants एसडीएस जेल वैद्युतकणसंचलन और immunoblotting द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण या RT-पीसीआर द्वारा विशिष्ट mRNAs की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 600 एनजी / explant, संस्कृति अवधि की लंबाई पर निर्भर करता है – प्रोटीन 20-50 μg / explant और आरएनए उपज से पैदावार रेंज लगभग 200 है. आम तौर पर हम पाते हैं कि पकवान प्रति 5-6 explants कई assays के लिए पर्याप्त प्रोटीन या शाही सेना प्रदान करेगा. Explants से शाही सेना भी माइक्रोएरे विश्लेषण, जो उपन्यास जीन है कि भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है की पहचान कर सकते हैं द्वारा जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए सीडीएनए तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Explants ट्रांसफ़ेक्ट भी हो सकता है. हालांकि अभिकर्मक दक्षता आम तौर पर कम है, यह रिपोर्टर जीन 4 परख करने की क्रिया के लिए पर्याप्त है, 7 , 8. Explants के immunofluorescence माइक्रोस्कोपी हित के प्रोटीन के subcellular स्थान निर्धारित कर जैव रासायनिक तरीकों के लिए एक उपयोगी सहायक प्रदान करता है. इस प्रकार, तैयारी और चूहे लेंस explants के संस्कृति स्तनधारियों में टर्मिनल लेंस भेदभाव के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली है, जो ट्रांसजेनिक और नाक आउट चूहों की पीढ़ी के रूप में में vivo तकनीक में पूरक कर सकते हैं प्रदान करता है.
लेंस उपकला explants की तैयारी डॉ. जॉन 9 मैकएवॉय की प्रयोगशाला में उत्पन्न तरीकों से अनुकूलित किया गया है. यह काम राष्ट्रीय नेत्र संस्थान, अंदर का रिसर्च प्रोग्राम Z01-EY000238-22 के द्वारा वित्त पोषित है