जेम्स थॉमसन एट अल के बाद से 1998 में एक तकनीक विकसित अलग करने और संस्कृति में HES बढ़ने, बाद में उपयोग के लिए और एक जमे हुए स्टॉक से कोशिकाओं विगलन और विस्तार ठंड कोशिकाओं दिनचर्या HES सेल संस्कृति में महत्वपूर्ण प्रदर्शन प्रक्रियाओं बन गए हैं. चूंकि HES कोशिकाओं को ठंड और विगलन के तनाव के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं, विशेष ध्यान रखा चाहिए. यहाँ हम तेजी से तरल नाइट्रोजन शेयरों से HES कोशिकाओं विगलन, उन्हें माउस भ्रूणीय फीडर कोशिकाओं पर चढ़ाना, और धीरे धीरे उन्हें लंबी अवधि के भंडारण के लिए ठंड के लिए उचित तकनीक का प्रदर्शन.
जेम्स थॉमसन के बाद से<em> एट अल</em> 1998 में एक तकनीक को अलग और संस्कृति में HES बढ़ने विकसित, बाद में उपयोग और एक जमे हुए स्टॉक से कोशिकाओं विगलन और विस्तार के लिए ठंड कोशिकाओं दिनचर्या HES सेल संस्कृति में महत्वपूर्ण प्रदर्शन प्रक्रियाओं बन गए हैं. चूंकि HES कोशिकाओं को ठंड और विगलन के तनाव के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं, विशेष ध्यान रखा चाहिए. यहाँ हम तेजी से तरल नाइट्रोजन शेयरों से HES कोशिकाओं विगलन, उन्हें माउस भ्रूणीय फीडर कोशिकाओं पर चढ़ाना, और धीरे धीरे उन्हें लंबी अवधि के भंडारण के लिए ठंड के लिए उचित तकनीक का प्रदर्शन.
साथ वीडियो विगलन और ठंड HES कोशिकाओं के लिए एक विधि दर्शाता है. तरल नाइट्रोजन में जमे हुए कक्ष जितनी जल्दी संभव स्नान thawed चाहिए सर्वोत्तम संभव वसूली प्राप्त करने . बहुत सावधान रहना जब विगलन कोशिकाओं pipetting याद रखें: कक्षों की हैंडलिंग कम से कम और धीरे विंदुक. HES कोशिकाओं की एक शीशी या तो 6 अच्छी तरह से, एक थाली या 4 अच्छी तरह से एक थाली के सभी कुओं की एक अच्छी तरह से एक पर चढ़ाया जा सकता है और तुरंत इनक्यूबेटर में रखा है. चार अलग – अलग कुओं में संवर्धन के बाद से संदूषण के लिए पूरी संस्कृति को खोने की संभावना कम कर देता है, और छोटे सतह क्षेत्र पर HES सेल कालोनियों का पता लगाने के लिए यह आसान बनाता है है, 4 अच्छी तरह से थाली जब पहली बार के लिए HES कोशिकाओं का विगलन की सिफारिश की है.
HES कोशिकाओं विगलन के बाद पहले दिन, कालोनियों छोटे हैं और पारदर्शी हो सकता है. HES सेल संस्कृति माध्यम हर दिन पुनर्भरण, भले ही कालोनियों माइक्रोस्कोप के अंतर्गत स्पष्ट नहीं कर रहे हैं क्योंकि यह HES कोशिकाओं के लिए एक संस्कृति में कुछ दिनों लेने के लिए स्थापित कालोनियों के रूप में प्रकट हो सकता है. यह महत्वपूर्ण है के लिए एक नया मढ़वाया MEF फीडर परत का उपयोग करें जब कोशिकाओं विगलन, कालोनियों के रूप में अक्सर पिघलना 10 12 दिनों के बाद जब तक passaging के लिए एक उपयुक्त आकार तक पहुँच नहीं करते.
जब HES कोशिकाओं की एक कम पारित होने शीशी विगलन, यह विस्तार करने के लिए और अतिरिक्त शीशियों को फ्रीज करने के लिए भविष्य की संस्कृति और प्रयोगों के लिए कम बीतने कोशिकाओं के एक शेयर को बनाए रखने अच्छा अभ्यास है. यह भी एक अच्छा विचार के लिए नियमित रूप से सभी "अतिरिक्त" स्वस्थ HES कोशिकाओं को फ्रीज करने के लिए जमे हुए शेयरों को बनाए रखने के लिए है. सबसे सफल thaws और बाद संस्कृतियों उच्च गुणवत्ता, undifferentiated, सक्रिय विभाजन HES सेल कालोनियों के रूप में जमे हुए थे. HES कोशिकाओं और अधिक कुशलता से ठीक एक फ्रीज से अगर बड़ा सेल समुच्चय के रूप में धीरे संभाला. अंतिम कुल आकार (या थोड़ा की तुलना में बड़ा) एक नियमित पारित होने के बाद मढ़वाया समुच्चय के आकार के लिए समान होना चाहिए.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF mediumjavascript:void(0); | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
|
D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | ||
Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells | |
bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final | |
Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | ||
L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
|
PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ | |
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 | |
Gelatin | Sigma | G1890 | Type A, Porcine | |
DMSO | Sigma | D2560 | For freezing medium | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | HyClone | SH300.70.01 | For freezing medium | |
6-well plates | Nunc | 140675 | For general culture | |
4-well plates | Nunc | 176740 | For thawing | |
5 mL glass pipettes | Fisher | 13-678-27E | Individually wrapped | |
15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene | |
Cryogenic vials | Nunc | 5000-1020 | 1.5 mL capacity | |
Freezing container | Nalgene | 5100-0001 | “Mr. Frosty” |