Eine Technik, um gleichzeitig zu visualisieren Virus-spezifische CD8 + T-Zellen und Virus-infizierten Zellen In situ Published: August 13, 2009 doi: 10.3791/1561

DOI

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Qingsheng Li¹, Pamela J. Skinner², Lijie Duan¹, Ashley T. Haase¹

¹Department of Microbiology, Medical School, University of Minnesota, ²Department of Veterinary and Biomedical Sciences, University of Minnesota

Summary

Eine Technik, die Kombination von in situ-Tetramer-Färbung und in situ-Hybridisierung (ISTH) ermöglicht die Visualisierung, Kartierung und Analyse der räumlichen Nähe von Virus-spezifischen CD8 + T-Zellen, um ihre Virus-infizierte Zielzellen, und die Bestimmung der quantitativen Beziehungen zwischen diesen Immunsystem Effektoren und Targets auf eine Infektion Ergebnisse.

Abstract

Die Zahlen und Standorte von Virus-spezifischen CD8 + T-Zellen bezogen auf die Anzahl und Standorte ihrer infizierten Zelle Ziele wird angenommen, dass kritische Bestimmung Ergebnissen, die von Spiel zu chronischen persistierenden Infektionen. Wir beschreiben hier eine Methode zur Beurteilung der räumlichen und quantitative Beziehungen zwischen Effektorzellen des Immunsystems (E)-Virus-spezifischen CD8 + T-Zellen und infizierten Ziele (T), die in situ-Tetramer (IST)-Färbung kombiniert, um Virus-spezifischen CD8 + T-Zellen erkennen und in situ Hybridisierung (ISH) auf virale RNA-+-Zellen in den Geweben, wo der Kampf zwischen Immunabwehr und Infektion erfolgt zu erkennen. Die Kombination von IST-Färbung und ISH, abgekürzt ISTH, ermöglicht die Visualisierung und Kartierung der Standorte von Immun-Effektorzellen und-ziele und einfache Bestimmung von E: T-Verhältnissen. Diese Parameter wiederum können dann verwendet werden, um die Beziehungen zwischen räumlicher Nähe zu bestimmen, und das Timing und das Ausmaß der Immunantwort, Ergebnisse vorherzusagen Anfang Infektion.

Protocol

Diese Methode wurde in der Forschung in gemeldet verwendet Li et al., Science 323, 1726 bis 1729 (2009) .

Kombinierte in situ Tetramer-Färbung und in situ-Hybridisierung (ISTH) Verfahren

ISTH Verfahren lassen sich in 4 Stufen eingeteilt werden: 1) IST Färbung von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen im Gewebe; 2) ISH auf Virus-infizierte-RNA + Zellen zu detektieren, 3) konfokale mikroskopische Bildgebung der IST-gefärbten Zellen und Virus-RNA + Zellen; 4) Bildanalyse, einschließlich des Baus von Bildmontagen und Kartierung von Tetramer + und Virus-RNA + Zellen.

1. IST-Färbung von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen in Gewebeschnitten.

1. Cut frische Gewebe in 200 um dicke Schnitte mit einem Vibratom oder Skalpell.
2. Gefühlt Vibratom Bad mit sterilem PBS-H und Chill auf 0-2 ° C. Stellen Sie die Vibratom Blattwinkel auf einem ziemlich steilen 27 °. Wann immer möglich, die dem Zellgewebe auf Eis gekühlt, um den Abbau zu minimieren. Frisches Gewebe ist auch leichter zu Abschnitt mit einem Vibratom, wenn es gekühlt.
3. Cut Gewebe mit chirurgischer Schere oder Skalpell in kleine ca. 0,5 cm breit und 0,25 cm hoch Stück. Put Gewebestücke in einer wiegen Boot oder Schälchen geben und mit ~ 40 ° C geschmolzen 4% PBS gepuffert niedrig schmelzende Agarose. Stellen Sie sicher, Gewebe in Kontakt mit dem Boden der Schale. Push-Gewebestücke ab, wenn sie schwimmen. Festigen Sie auf dem Eis. Dies dauert in der Regel 3-5 Minuten.
4. Coat Vibratom Gewebe-Block mit Loctite Kleber. Cut Agarose um das Gewebe mit dem Skalpell, und dann mit einer Pinzette vorsichtig Übertragung der fragilen Agarose eingebetteten Gewebe zu einem Vibratom Block in Leim bestrichen. Bewegen Sie sich nicht das Stück von Gewebe, wenn es auf das Gewebe Block gesetzt ist. Trocknen lassen ca. 10 Minuten auf dem Eis.
5. Berg Gewebe Block in der Vibratom und schneiden das Gewebe in 200um dicke Abschnitte mit einer Toten langsamen Fahrgeschwindigkeit und relativ hoher Amplitude. Geschwindigkeit und Amplitude Einstellungen variieren je nach Vibratom. Wenn ein Vibratom nicht verfügbar ist, oder das Gewebe ist nicht zugänglich Vibratom Schneiden, schneiden Gewebe in dünne Streifen mit einem Skalpell.
6. Transfer-Abschnitte mit einem Pinsel in ein Gewebe Kammer in die Vertiefung einer 24-well Zellkultur-Platte mit 1 ml der gekühlten PBS-H gesetzt. Legen Sie bis zu vier Gewebeschnitte in jedes Gewebe Kammer. Beschriften Sie die Deckel der Gewebekultur Platte mit experimentellen Probe Informationen und sichere Deckel auf die Platte mit einem Gummiband.
7. Alternativ kann für Gewebe, die nicht schneiden gut mit Vibratom, wie gut, kann geschnitten so dünn wie möglich Streifen mit dem Skalpell oder einer Rasierklinge. Legen Sie nur einen Abschnitt pro Vertiefung für Skalpell Schnitte.
8. Gehen Sie zur Färbung unmittelbar nach Abschluss Schneiden Gewebe. Keep Abschnitte gekühlt, um den Abbau zu allen Zeiten zu minimieren, bis fest. Lassen Sie sich nicht Abschnitten austrocknen. Halten Sie Abschnitte in gekühltem sterile PBS-H.
9. Inkubieren Gewebeschnitte über Nacht mit 0,5 mg / ml FITC-konjugierten Tetramere. Kann Maus oder Nicht-Kaninchen-Antikörper an extrazelluläre Epitope in dieser Inkubationszeit, zB Anti-CD8-Antikörper, verdünnt 1:200 in Blocking-Lösung gerichtet sind. Verwenden Sie 1 ml Lösung pro Vertiefung für diesen und alle folgenden Inkubationen, und führen Sie diese und alle folgenden Inkubationen bei 4 ° C mit Platten auf einem Schaukelstuhl Plattform. Keep Gewebe Kammern mit verschiedenen experimentellen Proben von mindestens einem leeren getrennt gut, um eine Kreuzkontamination von Lösungen in den nachfolgenden Schritten zu verhindern.
10. Nach der Grundschule Inkubation waschen Abschnitte mit gekühltem PBS-H zweimal (2X) für jeweils 20 Minuten. Tun Sie dies durch die Übertragung des Gewebes Kammern auf einen anderen 24-Well-Zellkultur-Platte mit gekühlt PBS-H. Achten Sie darauf, Inhalte aus einer experimentellen Probe in ein anderes tropfen, beim Bewegen Gewebe Kammern. Für alle folgenden Inkubationen und Waschungen ähnlich Transfer des Gewebes Kammern zu einer sauberen Teller mit den entsprechenden Lösung. Monitor-Abschnitte im Gewebe Kammern während Verfahren, um sicherzustellen, dass die Abschnitte nicht zu den Seiten des Gewebes Kammern stecken.
11. Fix Abschnitte mit frischem PBS gepuffert 4% Paraformaldehyd für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Waschen mit kaltem PBS-H 2X jeweils 5 min.
12. Inkubieren mit Kaninchen-anti-FITC-Antikörper, zB Biodesign1: 10.000, in Blocking-Lösung für 1-3 Tage. Für Co-Kennzeichnung können auch Nicht-Kaninchen-Antikörper an intrazelluläre Epitope in dieser Inkubation gerichtet als auch. Für diese Option setzen Epitope, wenn nötig und durchdringen und blockieren die Zellen vor der zweiten Inkubation.
13. Bei der Verwendung von Antikörpern an intrazelluläre Epitope, die Antigen-Retrieval verlangen von Formaldehyd Fixierung gerichtet, aussetzen Epitope durch Kochen 3 mal in 0,01 M Urea, jeweils 10 Sekunden Zeit, in der Mikrowelle. Warten Sie 2 Minuten zwischen jeder Heizung. Seien Sie sehr vorsichtig, wie kochende Lösung können die Abschnitte Kraft aus dem Brunnen. Wenn dies geschieht, verwenden Sie einen Pinselzu schieben Abschnitte von den Seiten des Gewebes Kammer oder aus dem Deckel der Platte wieder in den Boden des entsprechenden Gewebes Kammer. Wenn Antikörper nicht verlangen Antigen-Retrieval diesen Schritt auslassen.
14. Bei der Verwendung von Antikörpern an intrazelluläre Epitope gerichtet, vor der zweiten Inkubation permeabolize und Block-Zellen in Gewebeschnitten mit PBS-H mit 0,3% Triton X-100 und 2% normalem Ziegenserum für eine Stunde. Führen Sie dann verbleibenden Antikörper Inkubationen in PBS-H mit 0,3% Triton X-100 und 2% normalem Ziegenserum.
15. Nach der zweiten Inkubation waschen Sektionen in PBS-H für 20 Minuten bis mehrere Stunden. Wiederholen Sie zweimal für insgesamt drei Wäschen. Führen Sie eine abschließende Inkubation mit entsprechenden fluoreszenzmarkierten Antikörpern. Zum Beispiel, Ziege Anti-Kaninchen-Cy3 und Ziege anti-Maus-Alexa 488 1:1000 verdünnt jeweils in Blocking-Lösung. Inkubieren 02.59 Tage. Halten Sie Abschnitte von Licht durch das Einwickeln der Platten in Alufolie während dieser Inkubation und danach, wie das Licht löscht Fluorophore geschützt.
16. Wash Sektionen in PBS-H für 20 Minuten bis mehrere Stunden. Wiederholen Sie zweimal für insgesamt drei Wäschen.
17. Für IST mit ISH post-fix Abschnitte post-fix in 4% Paraformaldehyd für 1 Stunde zu sichern Tetramere und Antikörper in Ort kombiniert, dann spülen Abschnitte mit PBS-H wieder zu montieren.
18. Verwenden Sie einen Pinsel, um Abschnitte auf einen Objektträger übertragen. Coat jedem Abschnitt mit Glycerin / Gelatine enthält 4mg/ml n-Propylgallat oder andere Montage Medien mit einem Fluorophor Konservierungsmittel und mit einem Deckglas abdecken. Shop Dias in Licht geschützt schieben Behälter bei -20 °. Rinse-Zellkulturplatten und entfernen Sie Etiketten auf Deckeln mit Alkohol. Kann Platten wiederverwendet werden.
19. Analysieren gefärbten Gewebeschnitten mit einem konfokalen Mikroskop. Dann können wir fortfahren, ISH.

2. Detect-Virus-infizierten-RNA + Zellen durch in situ-Hybridisierung.

Diese in-situ-Hybridisierung Protokoll wurde von unseren bisher veröffentlichten Protokollen ^4,5 wie folgt geändert:

1. Re-cut 5-8 Mikrometer dicke-sectionss aus dickem in situ Tetramer gefärbten Schnitten.
   1. 200-Mikron-dick-Abschnitte werden bei 70 ° C für 5 min auf den Abschnitt von der Folie ablösen.
   2. Der Abschnitt wird dann in OCT auf Trockeneis eingebettet.
   3. 8-Mikron-Abschnitte werden mit einem Kryostaten von der dicke Schnitte geschnitten und verklebt auf silanisierte Dias.
   4. Dias können bei -80 ° C in einem verschlossenen Kasten für die anschließende in-situ-Hybridisierung gespeichert werden.
2. In-situ-Hybridisierung
   1. Rehydrieren Gewebeschnitten durch Eintauchen Rutschen für jeweils 3 min in 90% Ethanol und DEPC-behandeltem Wasser.
   2. Permeabilisieren Gewebeschnitten durch Erhitzen in 10 mM Citratpuffer (pH 6,0) bei 98 ° C in einem Wasserbad für 15 min.
   3. Coole Gewebeschnitte bei Raumtemperatur für 20-30 min.
   4. Zweimal waschen in DEPC-behandeltem Wasser für 3 min.
   5. Acetylieren Gewebeschnitt durch Eintauchen Folien in 0,25% Essigsäureanhydrid in 0,1 M TEA (Triethanolamin, pH 8,0) für 10 min.
   6. Objektträger in 0,1 M TEA (pH 8,0) für 5 min.
   7. Hybridisieren Abschnitte zu ³⁵ S-markierten Virus-spezifische (zB HIV-1, SIV) Antisense-Sonde oder Sinn (negative Kontrolle für HIV-1, SIV) oder ³⁵ S-markierten LCMV Ribosonden (gepoolte Sense-und Antisense).
   8. Wash Abschnitte zweimal mit 2 × SSC für 5 min nach Hybridisierung über Nacht bei 42 ° C.
   9. Wash Abschnitte in STE (0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCL, pH 7,5) für 5 min.
   10. Digest Abschnitte mit RNasen A und T1 in STE bei 37 ° C für 30 min
   11. Wash Abschnitte in 2x SSC plus 50% Formamid für 5 min.
   12. Wash Abschnitte in 1x SSC 10 min.
   13. Wash Abschnitte in 0,5 x SSC 15 min.
   14. Entwässern Sektionen in 70, 80 und 100% Ethanol mit 0,3 M Ammoniumacetat, jeweils 5 min.
   15. Coat Abschnitte mit Kernspur Emulsion
   16. Dry in einem dunklen Raum für 1 Stunde.
   17. Expose Abschnitte bei 4 ° C für 11 Tage (SIV) und 3 Tage (LCMV).
   18. Entwickeln Sie Abschnitte in D19 (Kodak, Cat # 146 4593) für 3 min, in dH2O 30 Sekunden waschen, in Rapid Fixer fix (Kodak, Cat # 146 4106) für 4 min, in dH2O 5 min x 3-mal waschen.
   19. Entwässern in 70%, 80% und absolutem Ethanol, jeweils 5 min.
   20. Berg rutscht in fluoreszierenden kompatibel Permount Medium.

3. Erwerben Sie konfokalen Mikroskop Bilder.

1. Erfassen ISTH Bilder mit einer Bio-Rad MRC 1000 Konfokalmikroskop, oder jede andere konfokalen Mikroskop mit EPI2-Blue Reflection Gerät.
2. Verwenden Sie Epi1-605 für den roten Tetramer Fluorochrom, EPI2-522 DF32 für die grüne CD8 Fluorochrom und der EPI2-Blue Reflection for Silberkörner (ISH-Signal in den entwickelten radioautographs) bei 20x (für SIV) oder 60x (für LCMV)
3. Nacheinander sammeln Z-Serien Bilder in 1-Mikrometer-Abständen in den drei Kanälen der einzelnen Felder.
4. Erwerben Sie Bilder von jedem Abschnitt von links nachrechts und oben nach unten, und der Name jedes Bild entsprechend seiner Zeile und Spalte in einer Excel-Datei.
5. Erfassen jedes Bild mit einem ~ 20% Überlappung mit den benachbarten Bilder, um Lücken in der rekonstruierten montage Bild zu vermeiden.

4. Bild analysiert: montage Bildrekonstruktion Zelle Schwerpunkt Berechnung und Analyse raumbezogener Daten.

1. Projekt Z-Serien-Bilder in einem einzigen Bild für jeden Kanal mit Confocal Assistant (Version 4.02.).
2. Automatisch verschmelzen das projizierte Bild aus drei Kanälen in einem RGB-Bild mit einem Photoshop 7.0 Aktion Verfahren.
3. Generieren Sie eine Montage Bild durch Nähen fusionierten Bilder zusammen in Schichten in Photoshop 7.0.
4. Assoziierte einzelnen Silberkörner und Tetramer mit Zellen färben, und weisen Sie die X-, Y-Koordinaten der Zentren (Schwerpunkte) des SIV-RNA + und Tetramer + Zellen unter Verwendung MetaMorph (Version 7.1.3.) Oder Photoshop (erhältlich beim Autor)
5. Export Schwerpunkt-Daten in Excel-Dateien als numerische Zahlen für jede Zelle. E: T-Verhältnissen aus der Excel-Dateien aus der Gesamtzahl der Tetramer + und virale RNA + Zellen in der Sektion bestimmt.

Räumliche Beziehungen zwischen Rot und Blau Tetramer + SIV RNA + Zellen sind durch Kopieren und Einfügen der jeweiligen Grundstücke aus der Excel-Dateien in ein Photoshop-Dokument erfasst. Nach Verringerung der Deckkraft einer Ebene ausrichten und skalieren Sie das Gitter so, dass sie, zusammen Farb-Auswahl und das Kopieren und Einfügen in eine neue Ebene die Positionen des blauen RNA +-Zellen, und legt danach die Schicht verwendet werden, um die Gitter auszurichten, die Positionen der Tetramer + und virale RNA + Zellen in die abgeflachte Bild enthüllt werden.

5. Zusätzliche Hinweise

Wenn Schneiden infektiöse Gewebe:

Arbeiten Sie in einem BSL2.5 Labor. Besondere Vorsichtsmaßnahmen mit Rasierklingen. Setzen Sie den Rasierer in die Vibratom Sägeblattaufnahme mit einer Pinzette. Wenn Sie sich nicht setzen die Klinge mit einer Pinzette, dann setzte es in vor der Zugabe von Gewebe, das Bad, und ersetzen nicht die Klinge. Wenn Sie fertig sind Schneiden, entfernen Sie die Klinge mit einer Pinzette. Spray Klinge mit 70% EtOH oder DMQ vor der Entfernung. Wie immer, von Blades in einem Entsorgungsboxen entsorgen. Ändern äußeren Handschuhe oder Spülen in Desinfektionsmittel nach jedem Kontakt mit dem Gewebe oder kontaminierte PBS im Tank. Wenn Sie fertig sind, wenn die Arbeit mit infektiösem Material, fügen DMQ Desinfektionsmittel zu PBS in Tank und lassen Sie sich ein paar Minuten vor dem Entfernen. Entsorgen dekontaminiert PBS den Bach runter. Dann spülen Sie den Tank mit Wasser, Salz und Desinfektionsmittel zu entfernen. Saubere Arbeitsfläche und Geräte mit DMQ. Spülen Sie das Geschirr mit Wasser.

To Make Tetramere von biotinylierten MHC Monomere:

Erhalten biotinylierten MHC Klasse I Moleküle wie HLA-A * 0201 / B ₂ m / Peptid-Moleküle mit entweder Gag (SLYNTVATL), Pol (ILKEPVHGV) oder irrelevant MART-Peptid (ELAGIGILTV) Peptide, die von Beckman Coulter produziert. Biotinylierten HLA-A * 0301 / B ₂ m / Peptid-Moleküle mit entweder Gag (KIRLRPGGK) oder Nef (QVPLRPMTYK) am NIAID Tetramer-Anlage produziert. Tetramere werden durch Zugabe von 6 Aliquots von FITC generiert ExtraAvidin (Sigma) an biotinylierte Mamu A * 01 / B ₂ m / Peptid-Monomere im Laufe von 8 Stunden, um eine endgültige Molverhältnis von 4,5:1. Die Logik hinter Addition der ExtrAvidin langsam ist, dass während der frühen Zeitpunkten gibt es ein Überangebot an Monomer, dass alle ExtrAvidin bekommt alle vier Biotin Seiten gebunden hinzugefügt versichert. Später in der Reaktion wird dabei weniger effizient, weil es weniger Monomer links und eine größere Chance, dass ExtrAvidin werden nicht alle 4 Standorte gebunden. Wenn hinzugefügt alle ExtrAvidin auf einmal die Reaktion wäre weniger effizient und ExtrAvidin Moleküle müssten nur 2 oder 3 Monomere befestigt.

Discussion

Da Virus-RNA als Marker für Virus-infizierten Zellen in diesem Bericht verwendet wird, sollten alle Reagenzien vor der Hybridisierung werden RNAase kostenlos. Die in-situ-Hybridisierung hier beschriebene Verfahren wurde geändert, um das Fluoreszenzsignal von in situ-Tetramer-Färbung erhalten. Da die radioautographic Signal von Virus-infizierten-Zellen nachgewiesen durch in situ Hybridisierung ist in einer Tiefe von etwa einem Zell-Durchmesser haben die dicke Schnitte für in situ-Tetramer-Färbung verwendet, um nachgeschnitten werden in 5-8 Mikrometer dicke Schnitte.

Diese neuartige Technik der Kombination in situ Tetrameren und in situ-Hybridisierung (ISTH) hier beschriebenen ermöglicht die gleichzeitige Visualisierung, Kartierung und Analyse der räumlichen Beziehung von Virus-spezifischen CD8 + T-Zellen und Virus-infizierten Zielzellen. Diese Methode kann angewendet CD8 + T-Zell-basierten Impfstoff zu bewerten und in anderen nicht-Virus-Erreger und Wirt-Interaktionen. Die Bildanalyse hier beschriebene Verfahren kann auch angepasst an die räumlichen Beziehungen von zwei Zellpopulationen Interaktion in situ zu studieren, zB haben wir vor kurzem verwendet den Schwerpunkt Mapping-Verfahren bei der Untersuchung von HIV-1 sexuellen Übertragung in der nicht-menschlichen Primaten-Modell von Simian Immundefizienz Virus-Infektion von Rhesusaffen ⁶

Materials

Solutions and Reagents:

PBS-H Phosphate buffered saline containing heparin (100ug/ml or 18.7U/ml) to inhibit RNASes RPMI tissue culture media containing heparin (100ug/ml or 18.7U/ml) to inhibit RNASes 4% low melt agarose in PBS PBS with 2% normal goat serum (or serum from species in which the fluorophore conjugated antibodies were made). PBS with 2% normal goat serum and 0.3% triton X-100 MHC class I tetramers conjugated to FITC Anti-FITC antibodies, e.g. BioDesign rabbit anti-FITC Fluorophore conjugated anti-rabbit IgG that has been highly cross adsorbed to other species IgG for use with multiple labeling, e.g. goat-anti-rabbit-Cy3 Fluorophore conjugated anti-mouse IgG that has been highly cross adsorbed to other species IgG for use with multiple labeling Fresh PBS buffered 4% paraformaldehyde 0.01M Urea Glycerol/gelatin containing 4mg/ml n-propyl gallate

Special equipment

Vibratome Scalpel Razor blades Surgical scissors Loctite Quick Set Instant Adhesive (product # 46551) Forceps #2 camel hair paint brushes. Can trim with razor blade to desired thickness 24-well flat bottomed tissue culture plates e.g. Falcon catalog #353226 Tissue chambers Tin foil Cardboard slide folder e.g. Fisher catalog#12-587-10 Confocal Microscope

IST Reagents Quick Reference

PBS-H (phosphate buffered saline with heparin)

450 ml 1X PBS 50 ml 1X PBS + 10X heparin

1x PBS + 10X heparin

500 ml 1X PBS 500 mg heparin powder (found on dry chemical storage shelf)

PBS-H/ 2% NGS (normal goat serum)

49 ml PBS-H in Falcon tube 1 ml NGS (found in 1 ml aliquots in -20 freezer)

PBS-H/ 2% NGS/ 0.3% Triton X-100

49 ml PBS-H/ 0.3% Triton X-100 in Falcon tube 1 ml NGS (found in 1 ml aliquots in -20 freezer)

PBS-H/ 0.3% Triton X-100

500 ml PBS-H 1.5 ml Triton X-100 (this is a thick liquid found on dry chemical storage shelves)

4% LMP Agarose

2 g LMP agarose powder 50 ml PBS Shake until mixed, microwave until powder dissolves.

GG-NPG (glycerol gelatin with n-propyl galate

Place a bottle of glycerol gelatin in 50 degree water bath to melt Add 0.06 g of propyl galate (found on Terri's shelf), shake well Keep in water bath, shaking occasionally until dissolved. Aliquot into 1 ml tubes (brown tubes)

4% paraformaldehyde

4 g paraformaldehyde powder (found on dry chemical storage shelves) Put about 10 ml PBS-H in a graduated cylinder, add pf powder Add some water until volume reaches about 70 ml Add one dropper of NaOH. Stir until dissolved (usually about 20-30 minutes) Add HCl until pH reaches between 7-8. Bring volume to 100 ml with water.

Urea 0.01 M

0.3 g urea (found on dry chemical storage shelves) 500 ml water