Il monitoraggio delle funzioni cardiaca in larvali Drosophila melanogaster Per gli Studi fisiologici

Summary

Vi presentiamo vari modi per monitorare la funzione cardiaca in larva di

Abstract

Vi presentiamo vari metodi per registrare la funzione cardiaca nei larvale

Protocol

INTRODUZIONE

I meccanismi cellulari della funzione del cuore sia per i vertebrati e gli insetti sono incredibilmente simili Drosophila melanogaster sono stati utilizzati per indagare le mutazioni genetiche che sono responsabili di stati di malattia in altri animali compreso l'uomo (Bier e Bodmer, 2004;.. Peron et al, 2009). Ora varie malattie sono state indotte in questo organismo trattabile genetica (Dowse et al, 1995;. Johnson et al, 1998;. Ganetzky, 2000; Bier e Bodmer, 2004;. Ocorr et al, 2007a, b) e con la speranza che La terapia genica in tempo possono essere testati per recuperare la funzione normale. Inoltre Drosophila servire come un buon modello per le funzioni fisiologiche a livello cellulare.

Molti degli studi sulla Drosophila cuore passato sono stati presi di mira verso gli aspetti di sviluppo nell'embrione (Azpiazu e Frasch 1993, Bodmer 1993, Bodmer et al. 1990). Alcuni studi di funzione fisiologica è verificato nelle fasi di pre-pupa, pupa o adulto (Ashton et al, 2001;. Lui e Adler, 2001; Molina e Cripps, 2001; Ponzielli et al, 2002;. Sláma e Farkas, 2005; Wessells e Bodmer, 2004). Tuttavia lo stadio di pupa è una delle metamorfosi e gli ormoni cambiando così come fluttuante ammine biogene varie. Anche il cuore è in fase di trasformazione strutturale che può rivelarsi difficile da controllare per le variabili nell'ambito delle indagini sulla fisiologia dei miociti (Dulcis et al 2005;. Johnson et al 2002;. Miller, 1997; Papaefthimiou e Theophilidis, 2001). Il cuore è conosciuto per essere miogenici nella fase larvale e può essere facilmente rimosso o lasciato in situ pur essendo bagnato da una soluzione salina fisiologica definita per limitare le variabili compounding come gli ormoni in circolo o peptidi (Dowse et al 1995;.. Johnson et al 1997 ; Dasari e Cooper, 2006; Feng et al 2004).. Il miogena del cuore larvale è paragonabile al cuore dei mammiferi in quanto vi sono pacemaker che guidano il resto del cuore di pompare fluidi in una direzione per essere efficace negli organi bagno. La natura cronotropa e ionotropici del cuore Drosophila larvale è di interesse in quanto potrebbe servire come un mezzo rapido per testare i principi fondamentali e gli effetti patologici per la funzione cuore dei mammiferi, nonché un aiuto per sviluppare un modello comparativo per la fisiologia cellulare, come la regolazione ionica pacemaker cellule.

Il cuore larvale è molto suscettibile di ammine biogene e peptidi che variano nel emolinfa seconda fonte di cibo o stato intrinseco dell'animale (Dasari e Cooper, 2006; Johnson et al 1997, 2000;.. Nichols et al 1999; Zornik et al . 1999). Rivolgendosi come composti endogeni o esogeni influenzano il cuore meccanicisticamente è di interesse. Insetticidi possibilmente romanzo con un minor numero di effetti su altri organismi possono essere sviluppati se vogliamo ottenere una migliore comprensione della fisiologia degli insetti e della farmacologia.

Il meccanismo cellulare di azione dei neurotrasmettitori e modulatori cardiaca in larve non sono state descritte fino ad oggi in quanto non vi è stata sufficiente comprensione delle correnti ioniche e tipi di canali presenti nel cuore larvale che contribuiscono e regolano l'attività del pacemaker. Per quanto sappiamo, non ci sono rapporti che documentano le registrazioni extracellulari o intracellulari di miociti per valutare correnti ioniche per affrontare gli effetti meccanicistica di modulatori in larvale Drosophila.

In questo rapporto presentiamo vari metodi per registrare la frequenza cardiaca e le proprietà fisiologiche del cuore larvale.

METODI

Larve intatte:

1. Un buon mezzo di visualizzare un cuore intatto battere larvale è direttamente con un microscopio, ma la larva deve rimanere ancora abbastanza per il conto delle contrazioni. Noi metodi di sviluppo di monitorare la frequenza cardiaca a muoversi liberamente larve e larve trattenuta. A seconda quelli sperimentali approccio un'altra domanda potrebbe essere più adatto di altri.
2. Questi approcci potrebbero essere usati per seguire un individuo per lunghi periodi di tempo se la cura viene utilizzata per evitare la disidratazione. Questi metodi possono essere utilizzati anche per valutare agenti farmacologici introdotti con la dieta o per esaminare vari momenti dello sviluppo in linee mutazionale o con l'induzione di geni shock termico.
3. Il metodo sfrenato prima cosa il termine "formicaio". Questa tecnica si compone di due lastre di vetro distanziate da un sottile strato di cibo delle larve. Le larve sono in grado di essere visualizzati all'interno di un piano di messa a fuoco. Questa tecnica è stata utilizzata anche per monitorare l'attività elettrica dal movimento circadiano in larva (Cooper e Cooper, 2004). Questa tecnica si compone di due lastre di vetro (vetrini da microscopio; 75 x 25 mm; Melvin J. Marca Freed) strettamente spaziati (1 a 1.5 mm) a parte da un sottile strato di cibo delle larve (es. umido pasto, una versione modificata del mais Lewis, 1960) in modo che le larve sono in grado di essere visualizzati all'interno di un piano di messa a fuoco. Distanziatori comunemente utilizzati per piatti gel elettroforesi (mini gel Bio-Rad, Life Science Research, Hercules, CA 94547, USA) funzionano molto bene in quanto possono essere acquistati con spessore variabile per l'uso con 1 °, 2 ° o 3 larve instar procedure formicaio. Anche un'opzione è quella di utilizzare una plastica solida di un certo spessore e tagliare fuori la regione da utilizzare come spazio strisciare.
4. Per evitare che le larve di strisciare fuori dai bordi delle due lastre di vetro è utilizzato un materiale plastico dello spessore desiderato. Leggermente inclinando la piattaforma da 20 a 45 gradi fa sì che il larve di rimanere, la maggior parte del tempo, con la loro testa rivolta verso il basso e la coda che contiene gli spiracoli sopra il cibo o all'interno di un passaggio dell'aria nello strato cibo.
5. Questa "tecnica Ant Farm" consente anche di immagini video all'interno di un unico piano con il cibo di spessore uniforme. In questa configurazione le larve tendono a non strisciare per tutto il cibo, ma invece di mangiare e di passaggio graduale in giro per il piano 2D. La luce bianca viene proiettato dalla parte inferiore del palco microscopio con uno specchio in modo che possa essere spostato di conseguenza per il miglior contrasto del cuore o le due trachea che si muovono mentre il cuore si contrae. Un microscopio (zoom regolabile 0,67-4,5; strumento di precisione mondiale; Modello 501379) è usato. Un obiettivo di base 2X e 0.5X tubo obiettivo è utilizzata per ottenere una risoluzione sufficiente spaziale e ingrandimento per coprire un rettangolo di 1 centimetro di 0,5 cm. Una telecamera montata attraverso un montaggio trinoculare è utilizzato (Mintron, MTV, strumento di precisione del Mondo). La temperatura ambiente è mantenuta a 20 ° C.

   
   Figura 1. Vista dorsale di un 3 intatti larva ^° stadio. Il movimento della trachea a causa di tirare su gli allegati dal cuore è utilizzato per osservare la frequenza cardiaca.

6. Per monitorare l'animale muoversi liberamente si può mettere qualche goccia di una miscela alimentare diluire sopra la testa degli animali. Questo dovrebbe essere fatto in un piatto di vetro così la luce trasmessa può passare attraverso le larve per la visualizzazione del tubo cuore. La microscopia stesso impostato come descritto sopra può essere usato per vedere il battito cardiaco e ottenere conteggi.
7. Un altro approccio è quello di frenare la larva di una posizione utilizzando del nastro adesivo doppio bastone su un vetrino e l'immissione sul lato ventrale della larva al nastro (Baker et al., 1999). Tuttavia questo approccio non funziona bene se il nastro si bagna durante l'alimentazione delle larve. Per evitare il nastro ottenere uno bagnato può usare vaselina (iniettato da un piccolo ago intorno alla base delle larve e intorno al bordo del nastro). Qui si può nutrire larve nel corso del tempo, senza dover inseguire le larve nel piano messa a fuoco o mentre si muove su un piatto. Se si vuole liberare le larve del nastro può essere inumidito e si perde è l'adesività per l'animale.

Se uno non è interessato a liberare le larve di sperimentazione si potrebbe utilizzare il metodo permanente di frenare la larva incollando l'animale a un vetrino. Con l'uso del metodo colla super, l'animale può mangiare e persino essere coperto in una soluzione di umido, pur rimanendo aderito allo scorrimento copertura in vetro. Le procedure sono:

1. Prendere un vetrino pulito e mettere un vetrino ad una estremità di esso.
2. Mettere una goccia di colla in un angolo della ricevuta di copertura.
3. Individuare la larva di Drosophila e rimuoverlo dalla provetta.
4. Posizionare la larva in una piastra di Petri e risciacquare con una piccola quantità di acqua per rimuovere qualsiasi cibo in eccesso.
5. Immergetevi alesatura cibo con l'angolo di un tessuto di piccole dimensioni o un tovagliolo di carta.
6. Delicatamente sollevare larva con le pinzette e mettetelo nella diapositiva sul lato opposto dal vetrino.
7. Mettere il vetrino sotto il microscopio e regolare la presta al larva. La larva dovrebbe essere sulla pancia con la schiena rivolta verso l'alto. È possibile distinguere tra i due lati della larva, perché loro spalle hanno due "Racing Stripes", che sono la trachea. Lo stomaco è debole scanalature orizzontali che corrono lungo con i capelli neri molto fini.
8. Se la larva è di fronte al modo scorretto, basta girare nel modo giusto con delicatezza lanciare sopra con il tuo pinzette.
9. Con un nuovo set di pinzette utilizzato specificamente per colla prendere un piccolo tamponare dal menu alla fine della vostra copertura antiscivolo e posizionarlo in un angolo del lato opposto. È necessario utilizzare un fractionally quantità di colla, appena sufficiente a coprire la testa delle pinzette. Inoltre, assicurarsi di pulire le estremità del vostro pinzette in modo che non diventino incollati chiusa.
10. Sotto il microscopio, controllare per assicurarsi che la larva è ancora nella posizione corretta. Se si è girato, vedere il passaggio otto.
11. Ora, con le pinzette utilizzato per gestire larva, pick up e la larvaposizionarlo delicatamente sulla patch fresco di colla. Assicurarsi che i ganci bocca nera si trovano nei pressi o sul bordo del vetrino e né loro o gli spiracoli marrone entrare in contatto con la colla.
12. Con attenzione premere verso il basso la larva per appiattire fuori.
13. Ora che la larva è a posto, è possibile amministrare le sostanze che si vuole testarli.
14. Ciò si realizza meglio se si usa una siringa per redigere la sostanza e il luogo in piccole dosi dalla testa della larva per esso di ingerire.
15. Infine, la frequenza cardiaca può essere osservato contando il numero di impulsi di spiracoli in un minuto.

In situ: Dissection e contare la frequenza cardiaca:

I preparativi sono a fessura lungo la metà ventrale asse longitudinale e appuntato piatto. Il piatto preparazione consisteva in una lastra di vetro (VWR) con del nastro magnetico (Migliori acquisti al dettaglio di-versa) aderito a un lato. Un buco nel centro della striscia magnetica permette la preparazione per essere visualizzato con luce trasmessa. Perni di dissezione (Fine Strumenti scientifici, WA) sono piegati e incollati al graffette. I fermagli sono facilmente manovrato sul nastro magnetico di tenere la preparazione filetti in posizione. Questo tipo di piatto registrazione è stato descritto in precedenza per l'utilizzo di pinning gangli isolato dal cordone nervoso ventrale sanguisuga (Muller et al., 1981).

1. Luogo intatto 3 larva instar sulla piastra dissezione. Ruota larva sul suo lato ventrale fino alla trachea non sono più visibili attraverso la cuticola.
2. Posto quattro perni in larva intatto. Due perni andare su entrambi i lati i ganci bocca, e due perni andare su entrambi i lati della spiracoli.
3. Aggiungi salina, e fare una incisione orizzontale una piccola distanza dai perni testa, poi continuare con una incisione orizzontale per tutta la lunghezza dell'asse longitudinale.
4. Fermare il taglio a breve distanza dal cuore vero. Taglio intorno al cuore vero e lungo il lato della spiracoli.
5. Sollevare un pin dorsale e agganciarlo sotto la cuticola. Usare il perno di aprire la cavità del corpo e la distese aperte. Ripetere questa operazione con i pin rimanenti.
6. Rimuovere le budella, facendo attenzione a non danneggiare né la trachea e cuore. Va notato che alcune strutture sono attaccati al cuore e può danneggiare se rimosso. Tra questi diversi corpi grassi, e il cervello. Se si può vedere il cuore che si stanno allungando durante la rimozione del fegato, smettere immediatamente di tentare di rimuovere tale struttura.

Il cuore è ora esposta e pronta per l'esposizione alle condizioni sperimentali.

Figura 2. Dissezione ventrale di un 3 ^° instar di visualizzare direttamente sul cuore. Pinning dell'animale sulla sua schiena dopo la dissezione viene utilizzato per applicare direttamente i composti sul cuore, con o senza sistema nervoso centrale intatto. Piccola freccia indica dove il cuore e l'aorta sono separati per transected studi vaso dorsale (vedi sotto). Tr, Trachea, Sp, spiracoli, H, Cuore, AO, Aorta.

Questa tecnica di dissezione è stata utilizzata per valutare direttamente agenti farmacologici sul cuore delle larve di Drosophila (Gu e Singh, 1995). Il tempo dissezione è di 3-6 min. La preparazione è permesso di rilassarsi immersi in HL3 soluzione salina per 3-5 minuti dopo la dissezione.

La soluzione salina HL3 è stato attentamente controllato per essere a pH 7,2 in quanto HR rallenta a pH elevato e velocità fino ad abbassare il pH (Badre et al., 2005). Gu e Singh (1995) usato a pH 7,0 per l'analisi farmacologica del cuore e ha anche mostrato la vitalità mantenuta. Durante queste prove la soluzione salina è rimasto aerato da agitazione di soluzione salina attraverso ripetutamente iniettando, attraverso una 21-gauge, in un bicchiere.

Per quantificare HR sia osservazioni dirette può essere utilizzato o le immagini possono essere registrate su nastri VHS o una fotocamera digitale per la riproduzione su uno schermo. Un metodo fotodiodo è già stato descritto (Dasari e Cooper, 2006).

L'esposizione a shock termico:

1. Sezionare larva.
2. Luogo preparazione sezionato su piastra di copertura.
3. Calore all'acqua del bagno.
4. Controllare la temperatura interna della vasca da galleggianti una sonda di temperatura su una piastra di copertura.
5. Quando la temperatura è soddisfacente, la preparazione luogo e piastra di copertura in bagno.
6. Lasciare in preparazione per un importo di tempo desiderato e rimuovere al termine.

Si può utilizzare ciò che ogni impulso di calore e temperatura necessarie per la loro sperimentazione.

Elettricamente guidare il cuore a ritmo:

1. Riempire un elettrodo di focale (circa 20 micron di diametro) utilizzando una siringa inserito e sigillato sul lato aperto e il disegno della temperatura ambiente (21 ° C) volare salina (HL3) nel elettrodo. Montare l'elettrodo nel manipolatore, controllando che °filo e si trova in soluzione salina dentro l'elettrodo e lo stimolatore è spento.
2. Luogo di preparazione una larva di Drosophila 3 instar larvale cuore sezionato il microscopio da dissezione e fissarlo in posizione. Posizionare il filo di terra nella salina della preparazione, attento a evitare il contatto con i perni ei lati della preparazione.
3. Utilizzare il manipolatore per posizionare la punta di un elettrodo sulla parte superiore del cuore, regolando la messa a fuoco del microscopio, se necessario. Il modo migliore per raggiungere questo obiettivo è mettere a fuoco l'elettrodo mentre si sposta verso il basso della punta.
4. Quando la punta è percepito di essere in posizione, lo stimolatore (modello S9 Instruments Erba, Quincy, Massachusetts, USA) dovrebbe essere attivata con la frequenza a 2 Hz, durata da 0,5 a 1 ms e la tensione sul valore più basso. L'impostazione di ritardo dovrebbe essere tra 12 e 14.
5. Osservando il ritmo del cuore, la frequenza dovrebbe essere girato a circa 3 Hz e la tensione lentamente aumentata fino a ritmo del cuore visto corrisponde al ritmo prodotto dal stimolatore. Normalmente il cuore volare sezionato batte ad una frequenza di circa 2 Hz, in modo che quando il ritmo stimolato è superiore al tasso intrinseco, il cuore si vedrà, il cuore sarà visto da battere a un ritmo più veloce del normale. Tensione non deve superare di circa 20 V come danno cellulare può avvenire a tensioni elevate, rendendo inutile la preparazione. Tipicamente, si può stimolare il cuore tra 2 e 8 V, a seconda della distanza e il sigillo creato sul cuore.
6. Se la tensione massima viene raggiunta e nessun effetto si vede, la polarità può essere invertita. Se anche questo non funziona, la sonda dovrebbe essere spostata a stabilire una migliore connessione sul cuore.
7. Una volta che un ritmo di stimolazione guidata è stabilito, il ritmo può essere manipolata variando la frequenza e le impostazioni di durata. Dovrebbe essere reso noto, tuttavia, che le frequenze superiori a 4 Hz, può mettere il cuore in tetania. Alcoli vari agenti farmacologici possono essere aggiunti e il loro effetto sulla giunzioni gap può essere osservato una volta che il ritmo desiderato è stabilito. Giunzioni gap bloccato non conducono una corrente e il ritmo propagato cesserà.
   
   
   Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Misurare il potenziale di campo:

1. Elettrodi di vetro sono fatti da Kimax vetro (diametro esterno: 1,5 mm). Il tubo di vetro viene tirato e fuoco lucidato a produrre punte di patch con diametro interno da 10 a 20 micron.
2. Il lume del l'elettrodo viene riempito con il mezzo bagno. L'amplificatore e la registrazione on line per un computer è lo stesso di quello utilizzato al di sotto per le registrazioni intracellulari.
3. Il lume di elettrodi registra un 'macro-patch' (Stuhmer et al., 1983) è collocato direttamente su una regione del cuore. La stimolazione spontanea delle fibre muscolari di produrre un potenziale campo che possono essere monitorati con l'elettrodo focale.
4. La cura deve essere data dal gentilmente abbassando e alzando il lume sopra ogni regione del cuore da monitorare. I potenziali sono registrati tramite una macro-patch elettrodo.

Conteggio diretto della frequenza cardiaca e il monitoraggio eventi elettrici è possibile. Alterare i mezzi di fare il bagno durante la registrazione di queste potenzialità è anche fattibile per valutare gli effetti sul campo le potenzialità.

Misurare il potenziale intracellulare:

Per monitorare il potenziale transmembrana dei miociti è impalato una regione del cuore con taglienti elettrodo intracellulare (20 a 30 mOhm resistenza) riempito con 3 M KCl. Un palco testa di serie e l'amplificatore per la registrazione intracellulare può essere utilizzato, ma abbiamo usato un modello Axonclamp 2B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) amplificatore e 1 X stadio testa LU. Sembra che alla fine caudale del cuore è più rigido e questo è dove risiedono le cellule pacemaker dal contrazione inizia in questa regione la maggior parte del tempo (Badre et al, 2005;. Dasari e Cooper, 2006; Dasari et al, 2007. ).

Materials

Dissection tools: Fine #5 tweezers and fine scissors (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Dissecting microscope with zoom function for dissection and counting heart rate. For focal stimulation of the heart this is needed as well. For extracellular and intracellular recordings a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope. Chemicals: All saline chemicals are obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO). For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch recording and stimulating electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter for the focal extracellular recording. For the stimulating electrode to drive the heart we use a final tip of about 20-50 μM in diameter. The shaft of the electrode is run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the heart tube as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.