Summary
Тромбоцитов каскада адгезии происходит в наличии сдвигового течения, фактор не учитывается в традиционных (статических) и пластины анализов. Эта статья отчеты по агрегации тромбоцитов, анализ использования микрожидкостных хорошо пластины формата для имитации физиологических условиях сдвига потока.
Abstract
Агрегация тромбоцитов происходит в ответ на повреждение сосудов, где внеклеточного матрикса ниже эндотелий подвергается. Тромбоцитов каскада адгезии происходит в наличии сдвигового течения, фактор не учитывается в традиционных (статических) и пластины анализов. Эта статья отчеты по агрегации тромбоцитов, анализ использования микрожидкостных хорошо пластины формата для имитации физиологических условиях сдвига потока. Внеклеточных белков, коллагена I или фактора фон Виллебранда откладываются в микрожидкостных каналов с использованием активных перфузии с пневматическим насосом. Матрица белки затем промывают буфером и заблокировали подготовить микрожидкостных канал для взаимодействия тромбоцитов. Цельная кровь помечены флуоресцентным красителем перфузии через канал при различных скоростях потока для достижения активации тромбоцитов и агрегацию. Ингибиторы агрегации тромбоцитов может быть добавлено до эксперимента проточной ячейки для получения данных IC50 дозового ответа.
Protocol
Часть 1: Подготовка микрожидкостных каналов пластины BioFlux.
- Перед запуском эксперимента проточной ячейки, необходимо подготовить микрожидкостных каналов с белком покрытие интересов. В этом случае, коллаген I будет использоваться. Каждый канал имеет вход и выход хорошо. Для этой пластинки, вход также является левым и кормления канала и выхода скважины на правом.
- Развести коллагена I (5mg/ml акций) покрытие 200μg/ml концентрации в 0,02 М уксусной кислоты. Один будет необходимо 20 мкл для каждого канала используется. Смешать, осторожно triteration с микропипетки чаевые.
- Добавьте 20 мкл покрытие каждого соответствующего канала будет использоваться. Надо отказаться от жидкости в к внутреннему удар розетки и кормления микрожидкостных каналов интерес использовании микропипетки. Избегайте введения пузыри, не толкать воздух из пипетки. Включите один канал без коллагена не коллагена контроля (отрицательный контроль для адгезии и агрегации).
- Прикрепить интерфейс для пластины первый палец ужесточение 4 винта, а затем, когда они все установлены, использование крутящего момента водителю полностью затянуть. Крутящий момент водитель будет нажимать, когда он достигает максимальной герметичности.
- Использование ручного режима в программном обеспечении BioFlux, применять перфузии на каналы проценты в 2dyn/cm 2-от розетки хорошо. При этом необходимо следить за противоположный внутренний удар должны быть заполнены жидкостью. Это займет несколько минут. Можно либо смотреть это произойдет использованием низких целью включения микроскопа (4X) и найти вход хорошо или, держа тарелку и смотреть во входное отверстие скважины снизу. Надо сначала посмотреть, крошечный шарик жидкости, которая медленно наполняет внутренний удар. После входа внутренний удар заполнен, остановить перфузии сразу, нажав остановку в программном обеспечении.
- Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение одного часа.
- Удалить интерфейс и добавить 1 мл PBS (плюс Ca 2 + / Mg 2 +) на выходе хорошо. Начало перфузии от розетки и при 2dyn/cm 2. Продолжить перфузии в течение 10 минут. Стоп перфузии и удалить интерфейс.
- Удалите излишки PBS с обеих входе и выходе скважины - никогда не удалить жидкость, которая заполняет внутренний удар. Блок каналов, используя блокирующий раствор (0,5% об. / BSA в PBS (плюс Ca 2 + / Mg 2 +)). Добавить 1 мл блокирование решения каждой торговой точки также будут использоваться и заливать из розетки, а на 2dyn/cm 2. Продолжить перфузии в течение 10 минут. Стоп перфузии и удалить интерфейс. Каналы подготовлены до этого шага могут быть использованы в течение дня.
- Перед добавлением крови, удалить жидкость с обеих сторон канала, за исключением внутренней ударов.
Часть 2. Подготовка крови с ГП IIb / IIIa тормозных антител.
- В то время как коллаген вынашиваются в каналы, надо готовиться цельной крови. Надо следить правил биобезопасности продиктовано его / ее института при работе с кровью человека.
- Свежая кровь человека (от поста индивидуального) втягивается в антикоагулянта цитрата натрия следует использовать в течение 3 часов после сбора.
- Подготовка крови, добавив 4μM кальцеин AM. Подготовка 4мм запас кальцеин AM в ДМСО и добавить в кровь в разведении от 1 / 1000 г / т. Смешать, осторожно инверсии.
- Внесите 1 мл кальцеин AM помечены крови в 10 - 1,5 мл пробирок. Добавить ГП IIb / IIIa ингибитор антитела к каждому в нужное разбавления (молекулярный вес IgG составляет ~ 150kDa). Серия пример разведения от 1200 нм до 9nM и включает в себя не контролирует антител и связанных контроль антител. Отличные положительного контроля за торможением бы ReoPro (абциксимаба, Eli Lilly) в концентрации 20ug/ml. Mix от нежного обращения.
- Инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа. Смешайте аккуратным переворачиванием каждые 10 минут.
Часть 3: Запуск эксперимента проточной ячейки на BF1000 рабочей станции.
- Во-первых, нужно создать автоматизированный протокол в модуль управления BioFlux. Для коллагена I, следует настроить протокол для запуска 10dyn/cm 2 в течение 10 минут из розетки хорошо. На данный момент, следует также установить сбор данных параметров с помощью BF1000 рабочей станции, в том числе канал позиции, захват в FITC длины волны и покадровой информации. Рекомендуется, чтобы захватить 3 поля зрения использования 10x цель каждого канала каждые 30 секунд по продолжительности 10 минут всего.
- Рабочие быстро, место 500ul подготовленных кровь каждого условия на отдельные подготовленные каналы. Место крови нет антител управления в канал, покрытый коллагеном и тот, который просто блокируется.
- Место интерфейс на тарелку.
- Место пластину на BF1000 микроскопом рабочей станции. Зажим на интерфейсе.
- Выполните язычок нагрузки. Кроме того, перемещение этапе одной скважины с кровью. Установить FTIC захвата изображения параметров (времени экспозиции, усиления и т.д ...).
- В программное обеспечение BioFlux монтаж, запуск приобретение начать потока и приобретения одновременно.
- Удалите пластину из BF1000 рабочей станции, распоряжаться пластины в соответствии с ведомственным руководящим принципам.
Часть 4: Представитель результаты.
Вот протокол для адгезии тромбоцитов и агрегацию в микрожидкостных каналов был представлен. Лечение ингибитором агрегации тромбоцитов, anti-GPIIb/IIIa был также включен в протокол. Использование коллагена покрытием микрожидкостных каналов системы BioFlux, следует ожидать, что агрессивное образование тромбов в течение долгого времени с необработанной пробы крови контроль и не тромба на немелованной канала. В одном из недавно провели эксперимент, средний размер агрегатов под контроль условий было 2000μm 2.
Рисунок 1. 
Активированные IIb / IIIa является мощным медиатором тромбоцитов взаимодействия тромбоцитов и агрегацию стабилизации 1. Адгезия к коллаген активизирует ГП IIb / IIIa комплекс, чтобы выявить этот ответ 2. После инкубации с anti-GPIIb/IIIa за 1 час до сдвига экспозиции, следует ожидать наблюдать уменьшение размеров тромбов, а также снижение частоты образования тромбов. Зависимость реакции от дозы как правило, может наблюдаться при 10dyn/cm 2.
Рисунок 2. 
IC 50 для данного ингибитора 17nM в 10 дин / см 2. Максимальное торможение (для этого донора) по сравнению с контролем нет антител составил 11% при 10 дин / см 2.
Хотя методы здесь были представлены с использованием конкретных внеклеточных белков матрицы и специфический ингибитор агрегации тромбоцитов, протокол является расширяемым, чтобы другие покрытия, другие типы клеток и других ингибиторов для анализов клеточной адгезии. Ключевые составляющие успеха подобных экспериментов являются избежание пузырей в микрожидкостных каналов, правильное разведение все реагенты в правильном разбавители, и соответствующие условия инкубации для всех реагентов.
Discussion
Хотя методы здесь были представлены с использованием конкретных внеклеточных белков матрицы и специфический ингибитор агрегации тромбоцитов, протокол является расширяемым, чтобы другие покрытия, другие типы клеток и других ингибиторов для анализов клеточной адгезии. Ключевые составляющие успеха подобных экспериментов являются избежание пузырей в микрожидкостных каналов, правильное разведение все реагенты в правильном разбавители, и соответствующие условия инкубации для всех реагентов.
Disclosures
Авторы являются сотрудниками флюксия Biosciences.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen I, Bovine | Reagent | Invitrogen | A1064401 | other sources of collagen I can be used |
| PBS plus Ca/Mg | Reagent | Invitrogen | 14040-117 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Reagent | EMD Millipore | EM-2930 Bottom of Form | From VWR |
| calcein AM | Reagent | Invitrogen | C1430 | Calcein AM from BD can also be used |
| BioFlux 1000 System | Reagent | Fluxion Biosciences | Contact Company | |
| BioFlux Plate | Reagent | Fluxion Biosciences | 900013 | |
| antiGPIIb/IIIa | Reagent | Abcam | ab33407 | an alternative # is ab15021 |
| ReoPro | Reagent | Eli Lilly | by Rx only |
References
- Jackson, S. P. The growing complexity of platelet aggregation. Blood. 109, 5087-5095 (2007).
- Nakamura, T., Kambayashi, J., Okuma, M., Tandon, N. N. Activation of the GP IIb-IIIa complex induced by platelet adhesion to collagen is mediated by both alpha2beta1 integrin and GP. VI. J Biol Chem. 274, 11897-11903 (1999).
