Summary
מפל הידבקות טסיות מתקיים בנוכחות זרימה גזירה, גורם לא היוו ב קונבנציונאלי (סטטי) היטב הצלחת מבחני. מאמר זה מדווח על assay טסיות צבירה תוך שימוש בתבנית microfluidic צלחת היטב לחקות פיסיולוגי תנאי הזרימה גזירה.
Abstract
צבירת טסיות דם מתרחשת בתגובה לפגיעה בכלי הדם שבו תאי מטריקס להלן האנדותל נחשף. מפל הידבקות טסיות מתקיים בנוכחות זרימה גזירה, גורם לא היוו ב קונבנציונאלי (סטטי) היטב הצלחת מבחני. מאמר זה מדווח על assay טסיות צבירה תוך שימוש בתבנית microfluidic צלחת היטב לחקות פיסיולוגי תנאי הזרימה גזירה. חלבונים תאיים, קולגן אני או גורם פון Willebrand מופקדים בתוך הערוץ microfluidic באמצעות זלוף פעיל עם משאבה פנאומטי. חלבונים מטריצה נשטפים אז עם חיץ וחסמו להכין את הערוץ microfluidic עבור אינטראקציות הטסיות. דם שלם שכותרתו עם צבע פלואורסצנטי הוא perfused דרך ערוץ ברמות ספיקה שונים על מנת להשיג ההפעלה אגרגציה של טסיות דם. צבירה של מעכבי טסיות ניתן להוסיף לפני הניסוי תזרים התא לייצר IC50 בתגובה לנתונים מנה.
Protocol
חלק 1: הכנת הערוצים microfluidic צלחת BioFlux.
- לפני הפעלת הניסוי התא זרימה, צריך להכין את ערוצי microfluidic עם ציפוי חלבון של עניין. במקרה זה, קולגן אני ישמשו. כל ערוץ יש מפרצון ולשקע היטב. עבור צלחת זו, כניסת גם הוא עזב גם להאכיל את ערוץ ולשקע גם הוא בצד ימין.
- לדלל את הקולגן אני (5mg/ml המלאי) ציפוי ריכוז 200μg/ml של חומצה אצטית 0.02M. אחת תצטרך 20μl לכל ערוץ בשימוש. מערבבים על ידי triteration עדין עם טיפ micropipette.
- הוסף 20 μl של ציפוי על כל ערוץ בהתאמה לשמש. צריך לוותר הנוזל לתוך להקיש הפנימי של משקע גם להאכיל את ערוץ microfluidic עניין באמצעות micropipette. הימנע מציגה בועות, לא לדחוף את האוויר מתוך פיפטה. כלול ערוץ אחד ללא קולגן שליטה לא קולגן (שליטה שלילי הידבקות וצבירה).
- חבר את ממשק הצלחת על ידי האצבע הראשונה הידוק 4 ברגים ואז כל פעם הם קבוצה, השתמש הנהג מומנט לחלוטין להדק. הנהג מומנט ילחצו כאשר הוא מגיע אטימות מירבית.
- שימוש במצב ידני בתוכנה BioFlux, להחיל זלוף לערוצים של ריבית 2dyn/cm 2-משקע היטב. כאן צריך להיזהר אגרוף הפנימי מול להתמלא בנוזל. זה ייקח כמה דקות. אפשר גם לראות את זה להתרחש באמצעות המטרה צריכת חשמל נמוכה על מיקרוסקופ (4X) ולמצוא את כניסת היטב או על ידי מחזיק את הצלחת להסתכל לתוך הבארות כניסת מלמטה. אחת צריך קודם לראות בטיפת נוזל לאט ממלא את האגרוף הפנימית. לאחר אגרוף הפנימי כניסת מלא, זלוף להפסיק בבת אחת על ידי לחיצה להפסיק בתוכנה.
- דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
- הסר את הממשק ולהוסיף 1 מ"ל של PBS (בתוספת Ca 2 + / Mg 2 +) לשקע היטב. התחל זלוף משקע היטב 2dyn/cm 2. המשך זלוף במשך 10 דקות. עצור זלוף ולהסיר את הממשק.
- הסר PBS עודף כניסת והן בארות לשקע - אף פעם לא להסיר את נוזל הממלא את האגרוף הפנימית. חסום את הערוצים באמצעות פתרון חסימה (0.5% v / v BSA ב PBS (בתוספת Ca 2 + / Mg 2 +)). הוסף 1 מ"ל של תמיסת חסימת לשקע כל טוב כדי לשמש perfuse משקע היטב 2dyn/cm 2. המשך זלוף במשך 10 דקות. עצור זלוף ולהסיר את הממשק. ערוצי מוכן עד שלב זה יכול לשמש לאורך כל היום.
- לפני הוספת דם, להסיר את נוזל משני צדי הערוץ למעט אגרופים הפנימית.
חלק 2. הכנת דם עם נוגדנים GPIIb / IIIa מעכבות.
- בעוד הקולגן הוא דוגרים בערוצים, חייבים להכין את כל הדם. אחד צריך לעקוב אחר תקנות biosafety מוכתב על ידי המכון שלו / שלה בעת הטיפול דם אדם.
- דם אדם טרי (מאדם בצום) להיגרר קרישה ציטרט הנתרן יש להשתמש בתוך 3 שעות של האוסף.
- הכן דם על ידי הוספת calcein 4μM PM. הכינו מלאי של 4 מ"מ calcein AM ב DMSO ולהוסיף דם דילול של 1 / 1000 v / נ מערבבים על ידי היפוך עדין.
- לוותר על 1 מ"ל של calcein AM שכותרתו דם לתוך 10 - 1.5mL microtubes. הוסף GPIIb / IIIa הנוגדן מעכב זה בדילול הרצוי (המשקל המולקולרי של IgG הוא ~ 150kDa). דוגמה לכך היא סדרת דילול מ 1200nM כדי 9nM וכולל בקרת אין נוגדנים ואת פקד הנוגדן קשור. לשלוט חיובי מצוין עיכוב יהיה ReoPro (abciximab, Eli Lilly) בריכוז של 20ug/ml. Mix ידי היפוך עדין.
- דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. מערבבים על ידי היפוך עדין כל 10 דקות.
חלק 3: הפעלת התא זרימה ניסוי בתחנת העבודה BF1000.
- ראשית, יש להגדיר את פרוטוקול אוטומטי במודול הבקרה BioFlux. עבור קולגן אני, יש להגדיר פרוטוקול לרוץ 10dyn/cm 2 במשך 10 דקות משקע היטב. בשלב זה, צריך גם להגדיר פרמטרים נתונים הרכישה באמצעות תחנת BF1000, כולל עמדות הערוץ, לתפוס גל FITC ואת זמן לשגות מידע. מומלץ לתפוס 3 בתחומי להציג באמצעות מטרה 10x לערוץ כל 30 שניות על פני משך זמן של 10 דקות בסך הכל.
- עבודה במהירות, 500ul של דם מוכן של כל תנאי לאפיקים מוכן להפריד מקום. אין מקום דם מלאה נוגדנים לתוך ערוץ זה מצופה קולגן זו חסומה עתה.
- מניחים את ממשק על הצלחת.
- מניחים את הצלחת על המיקרוסקופ עבודה BF1000. קלאמפ על הממשק.
- בצע התאמה עומס הצלחת. כמו כן, מהלך הבמה באר אחת המכילה דם. הגדר FTIC ללכוד תמונה הפרמטרים (זמן חשיפה וכו 'לזכות ...).
- בתוכנה BioFlux מונטאז', להתחיל רכישת להתחיל לזרום ורכישת בו זמנית.
- הסר את צלחת מתחנת עבודה BF1000, להיפטר צלחת בהתאם להנחיות מוסדיים.
חלק 4: תוצאות נציג.
הנה פרוטוקול של הידבקות אגרגציה של טסיות דם בערוצים microfluidic הוצג. טיפול מעכב אגרגציה של טסיות דם, anti-GPIIb/IIIa נכלל גם בפרוטוקול. באמצעות ערוצי קולגן מצופה microfluidic של מערכת BioFlux, יש לצפות היווצרות פקיק אגרסיבי לאורך זמן עם דגימת דם לא מטופל מלאה ללא היווצרות פקיק בערוץ ללא ציפוי. באחד הניסויים שבוצעו לאחרונה, הגודל הממוצע של אגרגטים בתנאים השליטה 2000μm 2.
באיור 1. 
הופעל GPIIb / IIIa הוא מתווך חזק של טסיות-טסיות אינטראקציות צבירה ייצוב 1. הדבקה על קולגן מפעיל את מורכבות GPIIb / IIIa לעורר את התגובה הזאת 2. לאחר הדגרה עם anti-GPIIb/IIIa שעה 1 לפני החשיפה גזירה, יש לצפות לצפות לירידה בגודל של thrombi כמו גם ירידה בשכיחות של היווצרות פקיק. התגובה תלויה במינון ניתן לבצע בדרך כלל שנצפה 10dyn/cm 2.
איור 2. 
הערך 50 IC עבור מעכב המסוים הזה היה 17nM ב 10 dyn / 2 ס"מ. עיכוב מרבית (עבור התורם הזה) לעומת שליטה אין את הנוגדן היה 11% ב 10 dyn / 2 ס"מ.
בעוד שיטות כאן הוצגו באמצעות חלבון מסוים תאי מטריקס ו מעכב ספציפי של אגרגציה של טסיות דם, הפרוטוקול הוא להרחבה ציפויים אחרים, סוגי תאים אחרים מעכבי אחרים עבור מבחני הידבקות התא. המרכיבים המפתח להצלחה של ניסויים כאלה הימנעות בועות ערוצי microfluidic, דילול נכון של כל ריאגנטים ב diluents נכונה, תנאי הדגירה מתאים ריאגנטים בכלל.
Discussion
בעוד שיטות כאן הוצגו באמצעות חלבון מסוים תאי מטריקס ו מעכב ספציפי של אגרגציה של טסיות דם, הפרוטוקול הוא להרחבה ציפויים אחרים, סוגי תאים אחרים מעכבי אחרים עבור מבחני הידבקות התא. המרכיבים המפתח להצלחה של ניסויים כאלה הימנעות בועות ערוצי microfluidic, דילול נכון של כל ריאגנטים ב diluents נכונה, תנאי הדגירה מתאים ריאגנטים בכלל.
Disclosures
הכותבים הם עובדי תורם של Fluxion Biosciences.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen I, Bovine | Reagent | Invitrogen | A1064401 | other sources of collagen I can be used |
| PBS plus Ca/Mg | Reagent | Invitrogen | 14040-117 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Reagent | EMD Millipore | EM-2930 Bottom of Form | From VWR |
| calcein AM | Reagent | Invitrogen | C1430 | Calcein AM from BD can also be used |
| BioFlux 1000 System | Reagent | Fluxion Biosciences | Contact Company | |
| BioFlux Plate | Reagent | Fluxion Biosciences | 900013 | |
| antiGPIIb/IIIa | Reagent | Abcam | ab33407 | an alternative # is ab15021 |
| ReoPro | Reagent | Eli Lilly | by Rx only |
References
- Jackson, S. P. The growing complexity of platelet aggregation. Blood. 109, 5087-5095 (2007).
- Nakamura, T., Kambayashi, J., Okuma, M., Tandon, N. N. Activation of the GP IIb-IIIa complex induced by platelet adhesion to collagen is mediated by both alpha2beta1 integrin and GP. VI. J Biol Chem. 274, 11897-11903 (1999).
