Summary
Die Plättchenadhäsion Kaskade erfolgt in Gegenwart von Scherströmung, ein Faktor, nicht entfielen in konventionellen (statischen) Well-Platte-Assays. Dieser Artikel berichtet über eine Thrombozyten-Aggregation-Assay unter Verwendung eines mikrofluidischen Well-Platte-Format auf physiologische Scherströmung Bedingungen zu emulieren.
Abstract
Thrombozytenaggregation tritt als Reaktion auf eine Gefäßverletzung, wo der extrazellulären Matrix unter dem Endothel ausgesetzt war. Die Plättchenadhäsion Kaskade erfolgt in Gegenwart von Scherströmung, ein Faktor, nicht entfielen in konventionellen (statischen) Well-Platte-Assays. Dieser Artikel berichtet über eine Thrombozyten-Aggregation-Assay unter Verwendung eines mikrofluidischen Well-Platte-Format auf physiologische Scherströmung Bedingungen zu emulieren. Extrazelluläre Proteine, Kollagen I oder von Willebrand-Faktor innerhalb der mikrofluidischen Kanal mit aktiven Perfusion mit einer pneumatischen Pumpe hinterlegt. Die Matrix-Proteine werden dann mit Puffer gewaschen und blockiert den mikrofluidischen Kanal für Thrombozyten-Interaktionen vorzubereiten. Vollblut mit Fluoreszenzfarbstoff markiert ist durch den Kanal bei verschiedenen Flussraten perfundiert, um die Thrombozyten-Aktivierung und Aggregation zu erreichen. Inhibitoren der Thrombozytenaggregation kann vor der Messzelle Experiment IC50 Dosis-Wirkungs-Daten zu generieren hinzugefügt werden.
Protocol
Teil 1: Vorbereitung der mikrofluidischen Kanälen eines BIOFLUX Platte.
- Vor dem Ausführen der Durchflusszelle Experiment, muss man die mikrofluidischen Kanälen mit einem Protein-Beschichtung von Interesse vorzubereiten. In diesem Fall, Kollagen I verwendet werden. Jeder Kanal verfügt über einen Einlass und einen Auslass gut. Für diese Platte, die Einlass und die linke und Fütterung des Kanals und der Ausgang auch auf der rechten Seite.
- Verdünnen Sie die Kollagen I (5mg/ml Lager) Beschichtung auf 200μg/ml Konzentration in 0,02 M Essigsäure. Man wird 20 &mgr; l für jeden Kanal verwendet müssen. Mix von sanften triteration mit einer Mikropipette Spitze.
- Add 20 ul Beschichtung auf dem jeweiligen Kanal verwendet werden. Man muss die Flüssigkeit in dem inneren Stempel der Steckdose und Fütterung der mikrofluidischen Kanal von Interesse mit einer Mikropipette zu verzichten. Vermeiden Sie die Einführung Blasen, nicht drücken die Luft aus der Pipette. Fügen Sie einen Kanal ohne Kollagen für eine nicht Kollagen-Steuerung (negative Kontrolle für die Adhäsion und Aggregation).
- Bringen Sie die Schnittstelle an die Platte, indem Sie zuerst den Finger Anziehen der 4 Schrauben und dann, sobald sie alle gesetzt sind, verwenden Sie das Drehmoment Fahrer komplett anziehen. Das Drehmoment-Treiber klicken, wenn es die maximale Dichtigkeit erreicht.
- Mit manuellen Modus in den BIOFLUX Software gelten Perfusion, um die Kanäle von Interesse an 2dyn/cm 2-aus der Steckdose gut. Hier muss man für das Gegenteil inneren Punsch mit Flüssigkeit gefüllt werden sehen. Dies wird einige Minuten dauern. Man kann entweder passen Sie dieses auftreten mit einem Low-Power-Ziel auf einem Mikroskop (4X) und die Suche nach dem Einlauf gut oder indem Sie die Platte und sucht in den Einlass Brunnen von unten. Man sollte zuerst eine winzige Kügelchen von Flüssigkeit, die langsam füllt den inneren Punsch. Sobald der Einlass inneren Punsch gefüllt ist, zu stoppen Perfusion auf einmal, indem Sie Halt in der Software.
- Die Platte bei Raumtemperatur für eine Stunde.
- Entfernen Sie die Schnittstelle und 1 ml PBS (plus Ca 2 + / Mg 2 +) zum Auslass gut. Starten Perfusion aus der Steckdose und am 2dyn/cm 2. Weiter Perfusion für 10 Minuten. Stop-Perfusion und entfernen Sie die Schnittstelle.
- Entfernen Sie überschüssiges PBS aus beiden Ein-und Auslass Brunnen - nie flüssiges, dass der innere Stempel füllt. Blockieren Sie die Kanäle mit Blocking-Lösung (0,5% v / v BSA in PBS (plus Ca 2 + / Mg 2 +)). 1 ml Blocking-Lösung in jede Steckdose gut genutzt werden und perfuse aus der Steckdose und am 2dyn/cm 2. Weiter Perfusion für 10 Minuten. Stop-Perfusion und entfernen Sie die Schnittstelle. Kanäle bis zu diesem Schritt bereit sind den ganzen Tag genutzt werden.
- Vor der Zugabe Blut, entfernen Sie die Flüssigkeit auf beiden Seiten des Kanals mit Ausnahme der inneren Stempel.
Part 2. Vorbereiten des Blutes mit GPIIb / IIIa hemmende Antikörper.
- Während das Kollagen in den Kanälen Inkubation ist, muss man vorbereiten Vollblut. Man sollte folgen der Biosicherheit Vorschriften diktiert von seinem / ihrem Institut im Umgang mit menschlichem Blut.
- Frisches menschliches Blut (von Nüchtern) in Natrium-Citrat als Antikoagulanz gezogen sollten innerhalb von 3 Stunden nach der Entnahme verwendet werden.
- Bereiten Sie das Blut durch Zugabe von 4 &mgr; m Calcein AM. Bereiten Sie ein 4mm Lager von Calcein AM in DMSO und fügen Sie Blut in einer Verdünnung von 1 / 1000 v / v. Mix durch vorsichtiges Schwenken.
- Dispense 1 ml der Calcein AM gekennzeichnet Blut in 10 - 1,5 ml Röhrchen. Add GPIIb / IIIa-Inhibitor-Antikörper gegen jeden in der gewünschten Verdünnung (das Molekulargewicht von IgG ~ 150kDa). Ein Beispiel Verdünnungsreihe von 1200nm bis 9Nm und beinhaltet eine nicht-Antikörper-Steuerung und einem nicht verwandten Antikörper-Kontrolle. Eine ausgezeichnete positive Kontrolle für die Inhibition würde ReoPro werden (Abciximab, Eli Lilly) in einer Konzentration von 20ug/ml. Mix durch vorsichtiges Schwenken.
- Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Mix durch vorsichtiges Schwenken alle 10 Minuten.
Teil 3: Ausführen der Durchflusszelle Experiment auf der BF1000-Workstation.
- Zunächst muss ein Satz ein automatisiertes Protokoll in der BIOFLUX Steuermodul. Für Kollagen I, sollte man die Einrichtung eines Protokolls zu 10dyn/cm 2 für 10 Minuten aus der Steckdose gut geführt. An dieser Stelle sollte man auch einrichten Datenerfassung Parameter mit dem BF1000-Workstation, einschließlich Kanal-Positionen, in FITC Wellenlänge und Zeitraffer-Informationen zu erfassen. Es wird empfohlen, 3 Felder der Ansicht mit einem 10-fach Objektiv pro Kanal alle 30 Sekunden über eine Dauer von 10 Minuten insgesamt zu erfassen.
- Arbeiten schnell, Platz 500 ul der vorbereiteten Blut von jedem Zustand in getrennten Kanälen vorbereitet. Legen Sie keine Antikörper Kontrolle Blut in einen Kanal, der mit Kollagen und eine, die gerade gesperrt ist beschichtet ist.
- Legen Sie die Schnittstelle auf der Platte.
- Legen Sie die Platte auf der BF1000 Workstation Mikroskop. Clamp an der Schnittstelle.
- Führen Platte Lasteinstellung. Auch bewegen Bühne, um ein gut mit Blut. Set FTIC Bilderfassung Parameter (Belichtungszeit, Verstärkung etc ...).
- In der BIOFLUX montage-Software, starten Akquisition zu fließen und Akquisition gleichzeitig beginnen.
- Die Platte aus BF1000-Workstation, der Platte nach den Richtlinien des Instituts zu entsorgen.
Teil 4: Repräsentative Ergebnisse.
Hier das Protokoll für die Adhäsion und Aggregation in mikrofluidischen Kanälen präsentiert wurde. Die Behandlung mit einem Thrombozytenaggregationshemmer, wurde anti-GPIIb/IIIa auch in das Protokoll aufgenommen. Mit Kollagen beschichtet mikrofluidischen Kanälen der BIOFLUX System, sollte man erwarten, dass aggressive Thrombusbildung im Laufe der Zeit sehen, mit der unbehandelten Kontrolle Blutprobe und keine Thrombenbildung auf der unbeschichteten Kanal. In einem kürzlich durchgeführten Experiment wurde die durchschnittliche Größe der Aggregate unter Kontrollbedingungen 2000μm 2.
Abbildung 1. 
Aktiviert GPIIb / IIIa ist potenter Mediator der Thrombozyten-Thrombozyten-Interaktionen und Aggregation Stabilisierung 1. Die Haftung an Kollagen aktiviert den GPIIb / IIIa-Komplex zu dieser Antwort 2 entlocken. Nach der Inkubation mit anti-GPIIb/IIIa für 1 Stunde vor Scher-Exposition, sollte man erwarten, eine Abnahme in der Größe von Thromben sowie eine Abnahme der Häufigkeit von Thromben beobachten. Eine dosisabhängige Reaktion kann in der Regel bei 10dyn/cm 2 beobachtet werden.
Abbildung 2. 
Die IC 50-Wert für diesen speziellen Inhibitor wurde 17Nm bei 10 dyn / cm 2. Die maximale Hemmung (für diese Spender) im Vergleich zu den nicht-Antikörper-Steuerung wurde um 11% auf 10 dyn / cm 2.
Während die Methoden hier vorgestellt wurden unter Verwendung eines spezifischen extrazellulären Matrix-Protein und ein spezifischer Inhibitor der Thrombozytenaggregation, ist das Protokoll, erweiterbar auf andere Beschichtungen, andere Zelltypen und andere Inhibitoren für die Zelladhäsion Assays. Die wichtigsten Zutaten für den Erfolg solcher Experimente sind die Vermeidung von Blasen in der mikrofluidischen Kanälen, richtige Verdünnung aller Reagenzien in der richtigen Verdünnungsmittel und entsprechende Inkubationsbedingungen für alle Reagenzien.
Discussion
Während die Methoden hier vorgestellt wurden unter Verwendung eines spezifischen extrazellulären Matrix-Protein und ein spezifischer Inhibitor der Thrombozytenaggregation, ist das Protokoll, erweiterbar auf andere Beschichtungen, andere Zelltypen und andere Inhibitoren für die Zelladhäsion Assays. Die wichtigsten Zutaten für den Erfolg solcher Experimente sind die Vermeidung von Blasen in der mikrofluidischen Kanälen, richtige Verdünnung aller Reagenzien in der richtigen Verdünnungsmittel und entsprechende Inkubationsbedingungen für alle Reagenzien.
Disclosures
Die Autoren sind Angestellte der Fluxion Biosciences.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen I, Bovine | Reagent | Invitrogen | A1064401 | other sources of collagen I can be used |
| PBS plus Ca/Mg | Reagent | Invitrogen | 14040-117 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Reagent | EMD Millipore | EM-2930 Bottom of Form | From VWR |
| calcein AM | Reagent | Invitrogen | C1430 | Calcein AM from BD can also be used |
| BioFlux 1000 System | Reagent | Fluxion Biosciences | Contact Company | |
| BioFlux Plate | Reagent | Fluxion Biosciences | 900013 | |
| antiGPIIb/IIIa | Reagent | Abcam | ab33407 | an alternative # is ab15021 |
| ReoPro | Reagent | Eli Lilly | by Rx only |
References
- Jackson, S. P. The growing complexity of platelet aggregation. Blood. 109, 5087-5095 (2007).
- Nakamura, T., Kambayashi, J., Okuma, M., Tandon, N. N. Activation of the GP IIb-IIIa complex induced by platelet adhesion to collagen is mediated by both alpha2beta1 integrin and GP. VI. J Biol Chem. 274, 11897-11903 (1999).
