Summary
De hechting van bloedplaatjes cascade vindt plaats in het bijzijn van shear flow, een factor niet goed voor in conventionele (statisch) goed-plaat assays. In dit artikel wordt verslag gedaan van een bloedplaatjes-aggregatie assay gebruik maakt van een microfluïdisch goed plaat formaat om fysiologische afschuifstroming omstandigheden na te bootsen.
Abstract
Trombocytenaggregatie treedt op in reactie op de schade aan de vaatwand, waar de extracellulaire matrix onder het endotheel is blootgesteld. De hechting van bloedplaatjes cascade vindt plaats in het bijzijn van shear flow, een factor niet goed voor in conventionele (statisch) goed-plaat assays. In dit artikel wordt verslag gedaan van een bloedplaatjes-aggregatie assay gebruik maakt van een microfluïdisch goed plaat formaat om fysiologische afschuifstroming omstandigheden na te bootsen. Extracellulaire eiwitten, collageen I of von Willebrand-factor zijn gedeponeerd in de microfluïdische kanaal met behulp van actieve perfusie met een pneumatische pomp. De matrix eiwitten worden vervolgens gewassen met buffer en geblokkeerd om de microfluïdische kanaal voor bloedplaatjes interacties te bereiden. Volbloed voorzien van fluorescerende kleurstof wordt doorbloed via het kanaal bij verschillende debieten om bloedplaatjes activering en aggregatie te bereiken. Trombocytenaggregatieremmers kan voorafgaand worden toegevoegd aan de stroom cel experiment om IC50 dosis-respons-gegevens te genereren.
Protocol
Deel 1: Voorbereiding van de microfluïdische kanalen van een BioFlux plaat.
- Voordat u de stroom cel experiment, moet men de microfluïdische kanalen te bereiden met een eiwit-coating van belang. In dit geval, collageen I zal worden gebruikt. Elk kanaal heeft een inlaat en een uitlaat goed. Voor deze plaat, de inlaat is goed de linker-en het voeden van het kanaal en de uitlaat goed is aan de rechterkant.
- Verdun de collageen I (5mg/ml voorraad) coating om 200μg/ml concentratie in 0,02 miljoen azijnzuur. Men zal moeten 20μl voor elke gebruikte kanaal. Meng door zachtjes te triteration met een micropipet tip.
- Voeg 20 ul van de coating aan iedere desbetreffende kanaal moet worden gebruikt. Men moet afzien van de vloeistof in tot innerlijke punch van de uitlaat goed voeden van de microfluïdische kanaal van belang met behulp van een micropipet. Voorkomen dat er luchtbellen, niet druk de lucht uit de pipet. Onder meer een kanaal zonder collageen voor een no-collageen controle (een negatieve controle voor de adhesie en aggregatie).
- Bevestig de interface naar de plaat door eerst de vinger het aandraaien van de 4 schroeven en dan zodra ze klaar, gebruik dan de Torque driver volledig vast te zetten. Het koppel chauffeur zal klikken wanneer zij tot de maximale dichtheid.
- Met behulp van manuele modus in de BioFlux software, gelden perfusie op de kanalen van de belangstelling op 2dyn/cm 2-uit het stopcontact goed. Hier moet men oppassen voor het tegenovergestelde innerlijke punch te worden gevuld met vloeistof. Dit zal enkele minuten duren. Men kan zien dit gebeuren met behulp van een laag vermogen doel op een microscoop (4X) en het vinden van de inlaat goed of door het houden van de plaat en op zoek naar de inlaat putten van onderen. Men moet eerst een kleine kraal van de vloeistof die langzaam vult het binnenste punch. Zodra de inlaat innerlijke punch is gevuld, stop perfusie in een keer door op stop in de software.
- Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende een uur.
- Verwijder de interface en voeg 1 ml PBS (plus Ca 2 + / Mg 2 +) op de uitlaat goed. Start perfusie uit het stopcontact goed bij 2dyn/cm 2. Blijven perfusie gedurende 10 minuten. Stop perfusie en verwijder de interface.
- Verwijder overtollige PBS van zowel in-en uitlaat putten - nooit te verwijderen vloeistof die de binnenste punch vult. Blokkeer de kanalen van de blokkering-oplossing (0,5% v / v BSA in PBS (plus Ca 2 + / Mg 2 +)). Voeg 1 ml van het blokkeren oplossing voor elk verkooppunt goed worden gebruikt en perfuseren uit het stopcontact goed bij 2dyn/cm 2. Blijven perfusie gedurende 10 minuten. Stop perfusie en verwijder de interface. Kanalen bereid tot deze stap kan worden gebruikt gedurende de dag.
- Voorafgaand aan het toevoegen van het bloed, verwijdert u de vloeistof aan beide zijden van het kanaal, behalve voor de innerlijke stoten.
Deel 2. De voorbereiding van het bloed met GP IIb / IIIa remmende antilichaam.
- Terwijl het collageen is incuberen in de kanalen, moet men de voorbereiding van de volbloed. Men moet volgen de bioveiligheid regels opgelegd door zijn / haar instelling bij de omgang met menselijk bloed.
- Verse menselijk bloed (van een nuchter persoon) getrokken in natriumcitraat antistollingsmiddel moet worden gebruikt binnen 3 uur van de collectie.
- Bereid het bloed door het toevoegen van 4μM calceïne AM. Bereid een 4mm voorraad calceïne AM in DMSO en toe te voegen aan het bloed in een verdunning van 1 / 1000 v / v. Meng door zachtjes te inversie.
- Doseer 1 ml van de calceïne AM gelabelde bloed in 10 - 1,5 ml microbuisjes. Voeg GP IIb / IIIa-remmer antilichaam aan elk op de gewenste verdunning (het molecuulgewicht van IgG is ~ 150kDa). Een voorbeeld verdunningsreeks is van 1200nm tot 9nM en bevat een antilichaam geen controle en een niet-verbonden antilichaam te controleren. Een uitstekende positieve controle voor remming zou ReoPro (abciximab, Eli Lilly) bij een concentratie van 20ug/ml. Meng door zachtjes te inversie.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Meng door voorzichtig omkeren elke 10 minuten.
Deel 3: Het uitvoeren van de stroom cel experiment op de BF1000 werkstation.
- Ten eerste moet een set-up een geautomatiseerd protocol in de BioFlux controle module. Voor collageen I, moet men het opzetten van een protocol voor 10dyn/cm 2 lopen gedurende 10 minuten uit het stopcontact goed. Op dit punt, moet men ook het opzetten van data-acquisitie parameters met de BF1000 workstation, inclusief kanaal posities vast te leggen in FITC golflengte en time-lapse informatie. Het wordt aanbevolen om drie velden van bekijken met behulp van een 10x objectief per kanaal elke 30 seconden via een duur van 10 minuten in totaal vast te leggen.
- Snel te werken, plaats 500ul van bereid bloed van elke voorwaarde in afzonderlijke kanalen voorbereid. Plaats geen antilichaamcontrole bloed in een kanaal dat is bekleed met collageen en een die net is geblokkeerd.
- Plaats de interface op het bord.
- Plaats de plaat op de BF1000 werkstation microscoop. Klem op de interface.
- Voer plaat belasting aanpassing. Ook verhuizen podium om een putje met bloed. Set FTIC Image Capture parameters (belichtingstijd, winnen etc ...).
- In de BioFlux montage software, start acquisitie te stromen en acquisitie tegelijk te beginnen.
- Haal de plaat uit BF1000 werkstation, afvoeren van de plaat volgens de institutionele richtlijnen.
Deel 4: Representatieve resultaten.
Hier is het protocol voor bloedplaatjes adhesie en aggregatie in microfluïdische kanalen werd gepresenteerd. Behandeling met een aggregatie van bloedplaatjes-remmer, werd anti-GPIIb/IIIa ook opgenomen in het protocol. Met behulp van collageen gecoate microfluïdische kanalen van het BioFlux systeem, moet men verwachten dat agressieve trombusvorming zien na verloop van tijd met de onbehandelde controle bloed en geen trombusvorming op de ongecoate kanaal. In een recent uitgevoerde experiment, de gemiddelde grootte van de aggregaten onder controle omstandigheden was 2000μm 2.
Figuur 1. 
Geactiveerde GP IIb / IIIa is krachtige mediator van bloedplaatjes-plaatjes interacties en aggregatie stabilisatie 1. Hechting aan collageen activeert de GP IIb / IIIa complex op te wekken deze reactie 2. Na incubatie met anti-GPIIb/IIIa gedurende 1 uur voorafgaand aan de shear blootstelling, dient men verwachten een afname van de omvang van trombi, evenals een afname van de frequentie van trombusvorming te observeren. Een dosis afhankelijke respons kan meestal worden waargenomen 10dyn/cm 2.
Figuur 2. 
De IC-50 waarde voor dit specifieke remmer was 17 Nm opgevoerd op 10 dyn / cm 2. Maximale remming (voor deze donor) in vergelijking met de geen antilichaam controle was 11% bij 10 dyn / cm 2.
Terwijl de methoden die hier zijn gepresenteerd met behulp van een specifieke extracellulaire matrix eiwit en een specifieke remmer van de bloedplaatjesaggregatie, het protocol is uitbreidbaar naar andere coatings, andere celtypes en andere remmers van celadhesie assays. De ingrediënten voor het succes van dergelijke experimenten zijn het vermijden van belletjes in de microfluïdische kanalen, de juiste verdunning van alle reagentia in de juiste verdunningsmiddelen, en adequate incubatie omstandigheden voor alle reagentia.
Discussion
Terwijl de methoden die hier zijn gepresenteerd met behulp van een specifieke extracellulaire matrix eiwit en een specifieke remmer van de bloedplaatjesaggregatie, het protocol is uitbreidbaar naar andere coatings, andere celtypes en andere remmers van celadhesie assays. De ingrediënten voor het succes van dergelijke experimenten zijn het vermijden van belletjes in de microfluïdische kanalen, de juiste verdunning van alle reagentia in de juiste verdunningsmiddelen, en adequate incubatie omstandigheden voor alle reagentia.
Disclosures
De auteurs zijn werknemers van Fluxion Biosciences.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen I, Bovine | Reagent | Invitrogen | A1064401 | other sources of collagen I can be used |
| PBS plus Ca/Mg | Reagent | Invitrogen | 14040-117 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Reagent | EMD Millipore | EM-2930 Bottom of Form | From VWR |
| calcein AM | Reagent | Invitrogen | C1430 | Calcein AM from BD can also be used |
| BioFlux 1000 System | Reagent | Fluxion Biosciences | Contact Company | |
| BioFlux Plate | Reagent | Fluxion Biosciences | 900013 | |
| antiGPIIb/IIIa | Reagent | Abcam | ab33407 | an alternative # is ab15021 |
| ReoPro | Reagent | Eli Lilly | by Rx only |
References
- Jackson, S. P. The growing complexity of platelet aggregation. Blood. 109, 5087-5095 (2007).
- Nakamura, T., Kambayashi, J., Okuma, M., Tandon, N. N. Activation of the GP IIb-IIIa complex induced by platelet adhesion to collagen is mediated by both alpha2beta1 integrin and GP. VI. J Biol Chem. 274, 11897-11903 (1999).
