Summary
La cascada de adhesión de las plaquetas se lleva a cabo en presencia de flujo de tensiones, no es un factor en cuenta en convencional (estática) y placa-ensayos. Este artículo informa sobre un ensayo de agregación plaquetaria utilizando una placa de microfluidos bien en formato de imitar las condiciones fisiológicas de flujo de corte.
Abstract
La agregación plaquetaria se produce en respuesta a la lesión vascular que ha sido la matriz extracelular por debajo del endotelio expuestos. La cascada de adhesión de las plaquetas se lleva a cabo en presencia de flujo de tensiones, no es un factor en cuenta en convencional (estática) y placa-ensayos. Este artículo informa sobre un ensayo de agregación plaquetaria utilizando una placa de microfluidos bien en formato de imitar las condiciones fisiológicas de flujo de corte. Proteínas extracelulares, el colágeno I y factor de von Willebrand se depositan en el canal de microfluidos con la perfusión activa con una bomba neumática. Las proteínas de la matriz se lavan con tampón y bloqueado para preparar el canal de microfluidos para la interacción de plaquetas. La sangre entera marcado con tinte fluorescente es perfundido a través del canal en diversos caudales con el fin de lograr la activación y agregación plaquetaria. Inhibidores de la agregación plaquetaria puede ser añadido antes del experimento celda de flujo para generar IC50 datos dosis-respuesta.
Protocol
Parte 1: Preparación de los canales de microfluidos de una placa BioFlux.
- Antes de ejecutar el experimento de la celda de flujo, es necesario preparar a los canales de microfluidos con una capa de proteína de interés. En este caso, el colágeno que se utiliza. Cada canal tiene una entrada y una salida así. Para este plato, la entrada, así es la izquierda y el canal de la alimentación y la salida y está a la derecha.
- Diluir el colágeno I (5mg/ml stock) de recubrimiento para la concentración 200μg/ml en ácido acético 0,02 M. Uno tendrá que 20μl para cada canal utilizado. Mezclar por triteration suave con una punta de la micropipeta.
- Añadir 20 l de recubrimiento para cada canal respectivo para ser utilizado. Hay que prescindir del líquido en perforar interior de la salida y la alimentación del canal de microfluidos de interés, utilizando una micropipeta. Evitar la introducción de burbujas, no se expulse el aire de la pipeta. Incluyen un canal sin colágeno para un control de colágeno no (un control negativo para la adhesión y agregación).
- Introduzca la tarjeta a la placa por el primer dedo de apretar los 4 tornillos y luego una vez que está todo listo, utilice el controlador de par de apriete por completo. El conductor del par se haga clic en cuando se alcanza el máximo de apriete.
- Utiliza el modo manual en el software BioFlux, se aplican a los canales de la perfusión de interés en 2dyn/cm 2 de la toma así. Aquí uno debe estar atento para el sacador contrario interior que se llena de líquido. Esto puede tomar varios minutos. Uno puede ver que esto ocurra con un objetivo de baja potencia en un microscopio (4X) y la búsqueda de la entrada del bien o mediante la celebración de la placa y busca en los pozos de entrada desde abajo. Uno debe ver primero una pequeña gota de líquido que llena lentamente el golpe interno. Una vez que el golpe interno de entrada está lleno, deje de perfusión a la vez pulsando parada en el software.
- Incubar la placa a temperatura ambiente durante una hora.
- Eliminar la interfaz y añadir 1 ml de PBS (además de Ca 2 + / Mg 2 +) a la salida también. Iniciar la perfusión de la toma de bien en 2dyn/cm 2. Continuar la perfusión durante 10 minutos. Detener la perfusión y eliminar la interfaz.
- Eliminar el exceso de PBS a partir de la entrada y salida de los pozos - no remover el líquido que llena el golpe interno. Bloquear los canales con solución de bloqueo (0,5% v / v de BSA en PBS (además de Ca 2 + / Mg 2 +)). Añadir 1 ml de solución de bloqueo a cada salida, así que se utilizarán y perfusión de la toma de bien en 2dyn/cm 2. Continuar la perfusión durante 10 minutos. Detener la perfusión y eliminar la interfaz. Canales preparado hasta este paso se puede utilizar durante todo el día.
- Antes de agregar la sangre, eliminar el líquido en ambos lados del canal a excepción de los golpes internos.
Parte 2. Preparación de la sangre con la GP IIb / IIIa de anticuerpos inhibidores.
- Mientras que el colágeno se está incubando en los canales, se debe preparar la sangre entera. Uno debe seguir las normas de bioseguridad dictadas por su / instituto en el manejo de sangre humana.
- Sangre humana fresca (de un individuo en ayunas), elaborado en anticoagulante citrato de sodio debe utilizarse a menos de 3 horas de su recolección.
- Preparar la sangre mediante la adición de calceína 4μM AM. Prepare un archivo de 4 mm de la mañana en DMSO calceína y añadir a la sangre a una dilución de 1 / 1000 v / v. Mezclar por inversión suave.
- Dispensar 1 ml de la calceína AM etiquetados sangre en 10 - 1,5 ml microtubos. Añadir GP IIb / IIIa de anticuerpos inhibidores de cada a la dilución deseada (el peso molecular de IgG es de ~ 150kDa). Una serie de dilución ejemplo es de 1200nm a 9nM e incluye un control de anticuerpos que no y un control de anticuerpos no relacionados. Un excelente control positivo para la inhibición sería ReoPro (abciximab, Eli Lilly) a una concentración de 20ug/ml. Mezclar por inversión suave.
- Incube a temperatura ambiente durante 1 hora. Mezclar por inversión suave cada 10 minutos.
Parte 3: Ejecución del experimento celda de flujo en la estación de BF1000.
- En primer lugar, hay que establecer un protocolo automatizado en el módulo de control BioFlux. De colágeno I, se debe establecer un protocolo para ejecutar 10dyn/cm 2 durante 10 minutos de la toma así. En este punto, también hay que configurar los parámetros de adquisición de datos utilizando la estación de trabajo BF1000, incluyendo posiciones de los canales, captura de longitud de onda FITC y la información de time-lapse. Se recomienda a la captura de tres campos de visión con un objetivo de 10x por canal cada 30 segundos durante una duración de 10 minutos en total.
- Trabajando rápidamente, el lugar 500 ul de sangre preparada de cada estado por separado en los canales preparados. Lugar hay sangre de anticuerpos de control en un canal que está recubierta con colágeno y que es bloqueada.
- Lugar de la interfaz de la placa.
- Coloque la placa en el microscopio de estación de trabajo BF1000. Abrazadera en la interfaz.
- Realice el ajuste de la placa de carga. Además, se mueven a una etapa de la sangre, así que lo contiene. Conjunto FTIC parámetros de captura de imágenes (el tiempo de exposición, etc ... la ganancia).
- En el software de BioFlux montaje, iniciar la adquisición de comenzar el flujo y la adquisición de forma simultánea.
- Retirar la placa de BF1000 estación de trabajo, eliminación de la placa de acuerdo con las directrices institucionales.
Parte 4: Los resultados representativos.
Aquí el protocolo de adhesión de las plaquetas y agregación de canales de microfluidos se presentó. El tratamiento con un inhibidor de la agregación plaquetaria, anti-GPIIb/IIIa también se incluyó en el protocolo. El uso de colágeno recubiertas canales de microfluidos del sistema BioFlux, se debe esperar para ver la formación de trombos agresivo en el tiempo con la muestra de sangre del control no tratado y no la formación de trombos en el canal sin revestir. En un experimento realizado recientemente, el tamaño medio de los agregados bajo condiciones de control se 2000μm 2.
Figura 1. 
Activado GP IIb / IIIa es potente mediador de la interacción plaqueta-plaqueta y agregación de estabilización 1. Adhesión al colágeno activa el complejo GPIIb / IIIa para obtener esta respuesta 2. Después de la incubación con anti-GPIIb/IIIa durante 1 hora antes de la exposición de corte, se debe esperar a observar una disminución en el tamaño de los trombos, así como una disminución en la frecuencia de formación de trombos. La respuesta depende de la dosis por lo general se puede observar en 10dyn/cm 2.
Figura 2. 
El valor de IC 50 de este inhibidor de particular fue 17nM a 10 dinas / cm 2. La inhibición máxima (para este donantes) en comparación con el control de anticuerpos no fue del 11% a 10 dinas / cm 2.
Mientras que los métodos aquí se presentaron con una proteína específica de la matriz extracelular y un inhibidor específico de la agregación plaquetaria, el protocolo es extensible a otros revestimientos, otros tipos de células y otros inhibidores para los ensayos de adhesión celular. Los ingredientes clave para el éxito de estos experimentos evitar burbujas en los canales de microfluidos, dilución correcta de todos los reactivos en los diluyentes correctos, y las condiciones adecuadas de incubación de los reactivos.
Discussion
Mientras que los métodos aquí se presentaron con una proteína específica de la matriz extracelular y un inhibidor específico de la agregación plaquetaria, el protocolo es extensible a otros revestimientos, otros tipos de células y otros inhibidores para los ensayos de adhesión celular. Los ingredientes clave para el éxito de estos experimentos evitar burbujas en los canales de microfluidos, dilución correcta de todos los reactivos en los diluyentes correctos, y las condiciones adecuadas de incubación de los reactivos.
Disclosures
Los autores que contribuyen son los empleados de Biociencias Fluxion.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen I, Bovine | Reagent | Invitrogen | A1064401 | other sources of collagen I can be used |
| PBS plus Ca/Mg | Reagent | Invitrogen | 14040-117 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Reagent | EMD Millipore | EM-2930 Bottom of Form | From VWR |
| calcein AM | Reagent | Invitrogen | C1430 | Calcein AM from BD can also be used |
| BioFlux 1000 System | Reagent | Fluxion Biosciences | Contact Company | |
| BioFlux Plate | Reagent | Fluxion Biosciences | 900013 | |
| antiGPIIb/IIIa | Reagent | Abcam | ab33407 | an alternative # is ab15021 |
| ReoPro | Reagent | Eli Lilly | by Rx only |
References
- Jackson, S. P. The growing complexity of platelet aggregation. Blood. 109, 5087-5095 (2007).
- Nakamura, T., Kambayashi, J., Okuma, M., Tandon, N. N. Activation of the GP IIb-IIIa complex induced by platelet adhesion to collagen is mediated by both alpha2beta1 integrin and GP. VI. J Biol Chem. 274, 11897-11903 (1999).
