Summary
La cascata l'adesione delle piastrine avviene in presenza di flusso di taglio, non un fattore contabilizzati nel convenzionali (statici) ben piastra saggi. Questo articolo riporta una aggregazione delle piastrine-test utilizzando un microfluidica ben piastra formato di emulare fisiologiche condizioni di flusso di taglio.
Abstract
L'aggregazione piastrinica si verifica in risposta al danno vascolare, dove la matrice extracellulare sotto l'endotelio è stato esposto. La cascata l'adesione delle piastrine avviene in presenza di flusso di taglio, non un fattore contabilizzati nel convenzionali (statici) ben piastra saggi. Questo articolo riporta una aggregazione delle piastrine-test utilizzando un microfluidica ben piastra formato di emulare fisiologiche condizioni di flusso di taglio. Proteine extracellulari, collagene I e fattore di von Willebrand sono depositate all'interno del canale microfluidico con perfusione attivo con una pompa pneumatica. Le proteine della matrice vengono poi lavate con tampone e bloccato per preparare il canale microfluidica per le interazioni delle piastrine. Di sangue intero marcato con colorante fluorescente è perfuso attraverso il canale a portate diverse al fine di ottenere l'attivazione piastrinica e aggregazione. Gli inibitori dell'aggregazione piastrinica può essere aggiunta prima dell'esperimento cella di flusso per generare IC50 dati dose-risposta.
Protocol
Parte 1: Preparazione dei canali microfluidica di un piatto BioFlux.
- Prima di eseguire l'esperimento cella di flusso, si ha la necessità di preparare i canali microfluidica con un rivestimento di proteine di interesse. In questo caso, collagene I verrà utilizzato. Ogni canale ha un ingresso e una presa bene. Per questo piatto, l'ingresso è ben a sinistra e che alimentano il canale e la presa bene è sulla destra.
- Diluire il collagene I (5mg/ml stock) rivestimento di concentrazione 200μg/ml 0.02M in acido acetico. Si dovranno 20μl per ogni canale utilizzato. Miscelare triteration dolce con una punta micropipetta.
- Aggiungere 20 ml di rivestimento a ciascun canale rispettivo da utilizzare. Bisogna distribuire il liquido in a pugni interno della presa di alimentazione e il canale microfluidica di interesse utilizzando una micropipetta. Evitare l'introduzione di bolle, non spingere l'aria fuori della pipetta. Comprendono un canale senza collagene per un alcun controllo collagene (un controllo negativo per l'adesione e l'aggregazione).
- Collegare l'interfaccia alla piastra per primo dito stringendo le 4 viti e poi una volta che sono tutti insieme, utilizzare il driver di coppia per stringere completamente. Il driver di coppia scatterà quando raggiunge la massima tenuta.
- Utilizzando la modalità manuale nel software BioFlux, applicare perfusione ai canali di interesse a 2dyn/cm 2-dalla presa bene. Qui si deve guardare per il pugno opposto interno da riempire con liquido. Ciò richiederà alcuni minuti. Né si può guardare questa verifica utilizzando un obiettivo a basso consumo su un microscopio (4X) e trovare l'insenatura bene o tenendo premuto il piatto e guardando nei pozzi di aspirazione dal basso. Prima cosa si dovrebbe vedere una goccia piccola di liquido che riempie lentamente il pugno interiore. Una volta che il pugno di ingresso interno è pieno, interrompere la perfusione in una sola volta premendo sosta nel software.
- Incubare la piastra a temperatura ambiente per un'ora.
- Rimuovere l'interfaccia e aggiungere 1 ml di PBS (più di Ca 2 + / Mg 2 +) alla presa bene. Avviare perfusione dalla presa bene a 2dyn/cm 2. Continua perfusione per 10 minuti. Smettere di perfusione e rimuovere l'interfaccia.
- Rimuovere l'eccesso di PBS sia da pozzi di aspirazione e scarico - non rimuovere il liquido che riempie il punzone interiore. Bloccare i canali con soluzione bloccante (0,5% v / v BSA in PBS (più di Ca 2 + / Mg 2 +)). Aggiungere 1 ml di soluzione di blocco per ogni presa bene da utilizzare e profumato dalla presa bene a 2dyn/cm 2. Continua perfusione per 10 minuti. Smettere di perfusione e rimuovere l'interfaccia. Canali disposti a questo passo può essere utilizzato tutto il giorno.
- Prima di aggiungere sangue, rimuovere il liquido su entrambi i lati del canale, tranne per i pugni interiore.
Parte 2. Preparazione del sangue con GP IIb / IIIa anticorpi inibitori.
- Mentre il collagene è incubando nei canali, bisogna preparare il sangue intero. Si dovrebbe seguire le norme di biosicurezza dettato dal suo / sua istituto durante la manipolazione del sangue umano.
- Fresco sangue umano (da un individuo a digiuno) coinvolto in anticoagulante citrato di sodio deve essere utilizzato entro 3 ore dalla raccolta.
- Preparare il sangue con l'aggiunta di 4 _m calceina AM. Preparare una 4mm stock di AM in DMSO calceina e aggiungere al sangue a una diluizione di 1 / 1000 v / v. Mescolare delicatamente per inversione.
- Dispensare 1 ml di calceina AM etichettato sangue in 10 - microprovette 1,5 ml. Aggiungi GP IIb / IIIa anticorpi inibitori a ciascuna alla diluizione desiderata (il peso molecolare di IgG è ~ 150kDa). Un esempio è la serie di diluizioni da 1200nm a 9nM e include un anticorpo alcun controllo e un controllo degli anticorpi non correlati. Un eccellente controllo positivo per l'inibizione sarebbe ReoPro (Abciximab, Eli Lilly) ad una concentrazione di 20ug/ml. Mescolare delicatamente per inversione.
- Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Mescolare delicatamente per inversione ogni 10 minuti.
Parte 3: L'esecuzione dell'esperimento cella di flusso sulla workstation BF1000.
- In primo luogo, è necessario predisporre un protocollo automatizzato nel modulo di controllo BioFlux. Per il collagene I, si dovrebbe istituire un protocollo per eseguire 10dyn/cm 2 per 10 minuti dalla presa bene. A questo punto, si dovrebbe anche impostare i parametri di acquisizione dati utilizzando la workstation BF1000, comprese le posizioni di canale, la cattura di lunghezza d'onda FITC e time-lapse informazioni. Si raccomanda di catturare 3 campi di vista con un obiettivo 10x per canale ogni 30 secondi per una durata di 10 minuti totali.
- Lavorando velocemente, luogo 500ul di sangue preparato di ogni condizione in canali separati preparati. Luogo nessun controllo del sangue degli anticorpi in un canale che è rivestito con collagene e uno che è appena bloccato.
- Posizionare l'interfaccia sul piatto.
- Posizionare la piastra su microscopio workstation BF1000. Morsetto sull'interfaccia.
- Eseguire la regolazione del carico piatto. Inoltre, passare ad una fase sangue pozzetto contenente. Set FTIC immagine parametri di acquisizione (tempo di esposizione, guadagno, ecc ...).
- Nel software BioFlux montaggio, inizia l'acquisizione per iniziare il flusso e l'acquisizione contemporaneamente.
- Rimuovere la piastra da BF1000 workstation, smaltire piastra secondo le linee guida istituzionali.
Parte 4: Risultati Rappresentante.
Qui il protocollo per l'adesione e aggregazione piastrinica nei canali microfluidica è stato presentato. Il trattamento con un inibitore dell'aggregazione piastrinica, anti-GPIIb/IIIa è stato anche incluso nel protocollo. Utilizzando collagene canali rivestiti microfluidica del sistema BioFlux, ci si dovrebbe aspettare di vedere aggressivo formazione di trombi nel tempo con il campione di sangue di controllo non trattato e senza formazione di trombi sul canale non rivestito. In un esperimento effettuato di recente, la dimensione media degli aggregati in condizioni di controllo è stato 2000μm 2.
Figura 1. 
Attivato glicoproteina IIb / IIIa è potente mediatore di piastrine-piastrine interazioni e aggregazione di stabilizzazione 1. Adesione al collagene attiva la glicoproteina IIb / IIIa complesso per suscitare questa reazione 2. Dopo l'incubazione con anti-GPIIb/IIIa per 1 ora prima dell'esposizione al taglio, ci si dovrebbe aspettare di osservare una diminuzione della dimensione di trombi così come una diminuzione della frequenza di formazione di trombi. Una risposta dose-dipendente in genere può essere osservato a 10dyn/cm 2.
Figura 2. 
Il valore 50 IC per questo inibitore particolare è stato 17nM a 10 dyn / cm 2. L'inibizione massima (per questo donatore) rispetto al non controllo degli anticorpi è stata dell'11% a 10 dyn / cm 2.
Mentre i metodi qui sono stati presentati con una specifica proteina della matrice extracellulare e di uno specifico inibitore dell'aggregazione piastrinica, il protocollo è estensibile ad altri rivestimenti, altri tipi di cellule e altri inibitori per saggi di adesione cellulare. Gli ingredienti chiave del successo di tali esperimenti siano evitare bolle nei canali microfluidica, la diluizione corretta di tutti i reagenti nei diluenti corretta e condizioni di incubazione appropriate per tutti i reagenti.
Discussion
Mentre i metodi qui sono stati presentati con una specifica proteina della matrice extracellulare e di uno specifico inibitore dell'aggregazione piastrinica, il protocollo è estensibile ad altri rivestimenti, altri tipi di cellule e altri inibitori per saggi di adesione cellulare. Gli ingredienti chiave del successo di tali esperimenti siano evitare bolle nei canali microfluidica, la diluizione corretta di tutti i reagenti nei diluenti corretta e condizioni di incubazione appropriate per tutti i reagenti.
Disclosures
Gli autori che contribuiscono sono dipendenti di Bioscienze flussione.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen I, Bovine | Reagent | Invitrogen | A1064401 | other sources of collagen I can be used |
| PBS plus Ca/Mg | Reagent | Invitrogen | 14040-117 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Reagent | EMD Millipore | EM-2930 Bottom of Form | From VWR |
| calcein AM | Reagent | Invitrogen | C1430 | Calcein AM from BD can also be used |
| BioFlux 1000 System | Reagent | Fluxion Biosciences | Contact Company | |
| BioFlux Plate | Reagent | Fluxion Biosciences | 900013 | |
| antiGPIIb/IIIa | Reagent | Abcam | ab33407 | an alternative # is ab15021 |
| ReoPro | Reagent | Eli Lilly | by Rx only |
References
- Jackson, S. P. The growing complexity of platelet aggregation. Blood. 109, 5087-5095 (2007).
- Nakamura, T., Kambayashi, J., Okuma, M., Tandon, N. N. Activation of the GP IIb-IIIa complex induced by platelet adhesion to collagen is mediated by both alpha2beta1 integrin and GP. VI. J Biol Chem. 274, 11897-11903 (1999).
