Summary
La cascade adhésion des plaquettes a lieu en présence du cisaillement, un facteur non pris en compte dans conventionnelle (statique) du bien-plaque de tests. Cet article rend compte d'un test d'agrégation plaquettaire en utilisant une plaque de microfluidique bien le format d'émuler les conditions physiologiques de flux de cisaillement.
Abstract
L'agrégation plaquettaire survient en réponse à une lésion vasculaire, où la matrice extracellulaire-dessous de l'endothélium a été exposé. La cascade adhésion des plaquettes a lieu en présence du cisaillement, un facteur non pris en compte dans conventionnelle (statique) du bien-plaque de tests. Cet article rend compte d'un test d'agrégation plaquettaire en utilisant une plaque de microfluidique bien le format d'émuler les conditions physiologiques de flux de cisaillement. Protéines extracellulaires, collagène de type I ou de facteur von Willebrand sont déposés dans le canal microfluidique en utilisant une perfusion active avec une pompe pneumatique. Les protéines de la matrice sont ensuite lavées avec du tampon et bloqué pour préparer le canal microfluidique pour les interactions plaquettes. Le sang entier marqués par un colorant fluorescent est perfusé par la voie à des débits différents afin de parvenir à l'activation des plaquettes et l'agrégation. Les inhibiteurs de l'agrégation plaquettaire peut être ajoutée avant l'expérience de cellule de flux de données pour générer des CI50 dose-réponse.
Protocol
Partie 1: Préparation des canaux microfluidiques d'une plaque BioFlux.
- Avant de lancer l'expérimentation cellule d'écoulement, on a besoin pour préparer les canaux microfluidiques avec un revêtement protéine d'intérêt. Dans ce cas, le collagène I seront utilisés. Chaque canal a une entrée et une sortie bien. Pour cette assiette, l'entrée est bien la gauche et le canal d'alimentation et la sortie de puits est sur la droite.
- Diluer le collagène de type I (5mg/ml stock) de revêtement pour la concentration 200μg/ml dans l'acide acétique 0.02M. Il faudra 20 pi pour chaque canal utilisé. Mélanger en triteration douce avec une pointe de micropipette.
- Ajouter 20 ul de revêtement pour chaque canal respectif pour être utilisé. Il faut passer le liquide dans de punch intérieur de la prise d'alimentation ainsi le canal microfluidique d'intérêt en utilisant une micropipette. Évitez d'introduire des bulles, ne poussez pas l'air de la pipette. Inclure un canal sans collagène pour un contrôle de collagène non (un contrôle négatif pour l'adhésion et l'agrégation).
- Fixez l'interface à la plaque par le premier doigt de serrer les 4 vis et puis une fois qu'ils sont tous ensemble, utiliser le tournevis dynamométrique de serrer complètement. Le chauffeur du couple va cliquer quand il atteint l'étanchéité maximale.
- En utilisant le mode manuel dans le logiciel BioFlux, appliquer perfusion pour les canaux d'intérêt à 2-2dyn/cm de la prise ainsi. Ici, on doit regarder pour le poinçon intérieure opposée à être rempli de liquide. Cela va prendre plusieurs minutes. On peut soit regarder ce produit en utilisant un objectif de faible puissance sur un microscope (4X) et de trouver l'entrée du puits ou par la tenue de la plaque et en regardant dans le puits d'entrée par le bas. Il faut d'abord voir un petit cordon de liquide qui remplit lentement le poinçon intérieure. Une fois le poinçon d'entrée intérieure est remplie, arrêter la perfusion à la fois en poussant arrêt dans le logiciel.
- Incuber la plaque à température ambiante pendant une heure.
- Enlever l'interface et ajouter 1 ml de PBS (plus de Ca 2 + / Mg 2 +) à la sortie de bien. Démarrer la perfusion de la prise ainsi au 2dyn/cm 2. Poursuivre la perfusion pendant 10 minutes. Arrêtez de perfusion et de supprimer l'interface.
- Enlever l'excès de PBS à la fois d'entrée et de sortie de puits - jamais enlever le liquide qui remplit le poinçon intérieure. Bloquer les canaux à l'aide la solution de blocage (0,5% v / v de BSA dans du PBS (plus de Ca 2 + / Mg 2 +)). Ajouter 1 ml de solution de blocage à chaque sortie ainsi être utilisé et perfuser de la prise ainsi au 2dyn/cm 2. Poursuivre la perfusion pendant 10 minutes. Arrêtez de perfusion et de supprimer l'interface. Canaux préparés à cette étape peut être utilisé tout au long de la journée.
- Avant d'ajouter du sang, enlever le liquide sur les deux côtés de la Manche à l'exception des poinçons intérieurs.
Partie 2. Préparer le sang avec GP IIb / IIIa d'anticorps inhibiteurs.
- Alors que le collagène est en incubation dans les canaux, on doit préparer le sang total. On devrait suivre les réglementations sur la biosécurité dicté par son / sa Institut lors de la manipulation du sang humain.
- Du sang frais humain (à partir d'un individu à jeun) entraînés dans un anticoagulant citrate de sodium doit être utilisé dans les 3 heures suivant le prélèvement.
- Préparer le sang en ajoutant calcéine 4μM AM. Préparer un stock de 4mm d'AM dans le DMSO calcéine et ajouter au sang à une dilution de 1 / 1000 v / v. Mélanger par inversion douce.
- Distribuer 1 ml de la calcéine AM étiquetés sang dans 10 - 1.5ml microtubes. Ajouter anticorps inhibiteur GP IIb / IIIa à chaque à la dilution souhaitée (le poids moléculaire des IgG est ~ 150kDa). Une série de dilution par exemple est de 1200nm à 9nM et inclut un contrôle des anticorps non et un contrôle des anticorps non liés. Un excellent contrôle positif pour l'inhibition serait REOPRO (abciximab, Eli Lilly) à une concentration de 20ug/ml. Mélanger par inversion douce.
- Incuber à température ambiante pendant 1 heure. Mélanger par inversion douce toutes les 10 minutes.
Partie 3: Exécution de l'expérience de cellules d'écoulement sur le poste de BF1000.
- D'abord, il faut mettre en place un protocole automatisé dans le module de contrôle BioFlux. Pour collagène I, on devrait mettre en place un protocole d'exécuter 10dyn/cm 2 pour 10 minutes de la sortie du bien. À ce stade, on devrait aussi définir les paramètres d'acquisition de données en utilisant le poste de travail BF1000, y compris des positions de canaux, la capture de longueur d'onde FITC et time-lapse d'information. Il est recommandé de capturer trois champs de vision en utilisant un objectif 10x par canal toutes les 30 secondes sur une durée de 10 minutes au total.
- En travaillant rapidement, placer 500ul de sang préparés de chaque condition en canaux distincts préparés. Placez pas de sang de contrôle d'anticorps dans un canal qui est revêtu de collagène et celui qui est juste bloqué.
- Placez l'interface sur la plaque.
- Placer la plaque sur le microscope poste BF1000. Clamp sur l'interface.
- Effectuez le réglage de charge assiette. Aussi, se déplacer à un stade de sang bien contenant. Set FTIC paramètres de capture d'image (temps d'exposition, etc gain ...).
- Dans le logiciel BioFlux montage, démarrer l'acquisition de commencer et l'acquisition de flux simultanément.
- Retirer la plaque de BF1000 poste de travail, disposer de la plaque, conformément aux directives institutionnelles.
Partie 4: résultats représentatifs.
Voici le protocole d'adhésion des plaquettes et l'agrégation de canaux microfluidiques a été présenté. Le traitement avec un inhibiteur de l'agrégation plaquettaire, anti-GPIIb/IIIa a également été inclus dans le protocole. Utiliser revêtues de collagène canaux microfluidiques du système BioFlux, on devrait s'attendre à voir agressive formation de thrombus au cours du temps avec l'échantillon de sang de contrôle non traité et sans formation de thrombus sur le canal non couché. Dans une expérience effectuée récemment, la taille moyenne des agrégats dans des conditions de contrôle a été 2000μm 2.
Figure 1. 
Activé GP IIb / IIIa est puissant médiateur de plaquettes et l'agrégation plaquettaire interactions de stabilisation 1. Adhésion au collagène active le complexe GP IIb / IIIa pour susciter cette réaction 2. Après incubation avec anti-GPIIb/IIIa pendant 1 heure avant l'exposition au cisaillement, on devrait s'attendre à observer une diminution de la taille du thrombus ainsi qu'une diminution de la fréquence de la formation de thrombus. Une réponse dose-dépendante peut généralement être observé à 10dyn/cm 2.
Figure 2. 
La valeur de CI50 pour cet inhibiteur particulier a été 17nM moins 10 dynes / cm 2. L'inhibition maximale (pour ce donneur) comparativement au témoin sans anticorps était de 11% à 10 dyn / cm 2.
Bien que les méthodes ont été présentées ici, en utilisant une protéine de la matrice extracellulaire et spécifiques d'un inhibiteur spécifique de l'agrégation plaquettaire, le protocole est extensible à d'autres revêtements, d'autres types cellulaires et d'autres inhibiteurs des tests d'adhésion cellulaire. Les ingrédients clé de la réussite de ces expériences sont l'évitement des bulles dans les canaux microfluidiques, la dilution correcte de tous les réactifs dans les diluants corrects, et les conditions d'incubation appropriés pour tous les réactifs.
Discussion
Bien que les méthodes ont été présentées ici, en utilisant une protéine de la matrice extracellulaire et spécifiques d'un inhibiteur spécifique de l'agrégation plaquettaire, le protocole est extensible à d'autres revêtements, d'autres types cellulaires et d'autres inhibiteurs des tests d'adhésion cellulaire. Les ingrédients clé de la réussite de ces expériences sont l'évitement des bulles dans les canaux microfluidiques, la dilution correcte de tous les réactifs dans les diluants corrects, et les conditions d'incubation appropriés pour tous les réactifs.
Disclosures
Les auteurs sont des employés de contribuer Biosciences Fluxion.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen I, Bovine | Reagent | Invitrogen | A1064401 | other sources of collagen I can be used |
| PBS plus Ca/Mg | Reagent | Invitrogen | 14040-117 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Reagent | EMD Millipore | EM-2930 Bottom of Form | From VWR |
| calcein AM | Reagent | Invitrogen | C1430 | Calcein AM from BD can also be used |
| BioFlux 1000 System | Reagent | Fluxion Biosciences | Contact Company | |
| BioFlux Plate | Reagent | Fluxion Biosciences | 900013 | |
| antiGPIIb/IIIa | Reagent | Abcam | ab33407 | an alternative # is ab15021 |
| ReoPro | Reagent | Eli Lilly | by Rx only |
References
- Jackson, S. P. The growing complexity of platelet aggregation. Blood. 109, 5087-5095 (2007).
- Nakamura, T., Kambayashi, J., Okuma, M., Tandon, N. N. Activation of the GP IIb-IIIa complex induced by platelet adhesion to collagen is mediated by both alpha2beta1 integrin and GP. VI. J Biol Chem. 274, 11897-11903 (1999).
