Summary
Den trombocyter vidhäftning kaskaden sker i närvaro av skjuvning flöde, svarade en faktor inte i konventionella (statisk) väl platta analyser. Denna artikel rapporterar om en trombocyt-aggregation analysen använder en mikroflödessystem väl platta format för att efterlikna fysiologiska klippa flöde.
Abstract
Trombocytaggregation svar på vaskulär skada där den extracellulära matrisen under endotelet har utsatts. Den trombocyter vidhäftning kaskaden sker i närvaro av skjuvning flöde, svarade en faktor inte i konventionella (statisk) väl platta analyser. Denna artikel rapporterar om en trombocyt-aggregation analysen använder en mikroflödessystem väl platta format för att efterlikna fysiologiska klippa flöde. Extracellulära proteiner, kollagen I och von Willebrands faktor deponeras inom mikroflödessystem kanal med aktiv perfusion med en pneumatisk pump. Matrisen proteiner sedan tvättas med buffert och blockerade för att förbereda mikroflödessystem kanal för trombocyt interaktion. Helblod märkta med fluorescerande färg är perfusion genom kanalen vid olika flöden i syfte att uppnå trombocytaktivering och aggregation. Hämmare av trombocytaggregation kan läggas före flödescellen försöket att generera IC50 uppgifter dos-respons.
Protocol
Del 1: Förberedelse av mikroflödessystem kanaler en BioFlux tallrik.
- Innan du kör experimentet flödescellen måste man förbereda mikroflödessystem kanaler med ett protein beläggning av intresse. I det här fallet, jag kollagen kommer att användas. Varje kanal har ett inlopp och ett utlopp väl. För denna platta är inloppet väl vänster och utfodring kanalen och utloppet är väl till höger.
- Späd kollagen I (5mg/ml lager) beläggning för att 200μg/ml koncentration i 0.02M ättiksyra. Man kommer att behöva 20μl för varje använd kanal. Blanda genom försiktig triteration med en mikropipett spets.
- Tillsätt 20 l av beläggning till respektive kanal som skall användas. Man måste fördela vätskan sugs in till inre punch av verksamhetsstället väl mata mikroflödessystem kanal av intresse med hjälp av en mikropipett. Undvika att införa bubblor du inte trycka ut luften ur pipetten. Inkludera en kanal utan kollagen för ett nej kollagen kontroll (en negativ kontroll för vidhäftning och aggregering).
- Fäst gränssnitt till plattan genom att först fingret dra åt de 4 skruvarna och sedan när de är redo, använd vridmoment föraren att helt dra åt. Vridmomentet Föraren kommer att klicka när den når maximal täthet.
- Använda manuellt läge i BioFlux programvaran gäller perfusionen till de kanaler av intresse på 2dyn/cm 2-från vägguttaget också. Här måste man titta på det motsatta inre punch att fyllas med vätska. Detta kommer att ta flera minuter. Man kan antingen se detta ske med hjälp av en strömsnål mål om ett mikroskop (4X) och att hitta inloppet bra eller genom att hålla plattan och tittar in i inloppet brunnar underifrån. Man bör först se en liten droppe vätska som långsamt fyller den inre punch. När inloppet inre punch är fylld, stoppa perfusion på en gång genom att trycka stopp i programvaran.
- Inkubera plattan i rumstemperatur i en timme.
- Ta bort gränssnitt och tillsätt 1 ml PBS (plus Ca 2 + / Mg 2 +) till utloppet väl. Starta perfusionen ur vägguttaget bra på 2dyn/cm 2. Fortsätt perfusion i 10 minuter. Stoppa perfusion och ta bort gränssnitt.
- Ta bort överflödigt PBS från både in-och brunnar utlopp - aldrig ta bort vätska som fyller de inre punch. Blockera kanalerna med hjälp av blockerande lösningen (0,5% v / v BSA i PBS (plus Ca 2 + / Mg 2 +)). Tillsätt 1 ml av blockerande lösningen till varje uttag och som skall användas och BEGJUTA från uttaget bra på 2dyn/cm 2. Fortsätt perfusion i 10 minuter. Stoppa perfusion och ta bort gränssnitt. Kanaler beredd till detta steg kan användas hela dagen.
- Innan man tillsätter blod, ta bort vätskan på båda sidor av kanalen, utom för den inre slag.
Del 2. Förbereda blod med GPIIb / IIIa-hämmande antikroppar.
- Medan kollagen ruvar i kanalerna måste man förbereda helblod. Man bör följa biosäkerhet regler som dikteras av hans / hennes institution vid hantering av blod.
- Färskt blod (från en fastande individ) dras in i natriumcitrat antikoagulantia bör användas inom 3 timmar efter provtagning.
- Förbered blod genom att lägga 4μM kalcein AM. Förbered en 4mm lager av kalcein AM i DMSO och lägga till blod i en spädning på 1 / 1000 v / v. Blanda genom att vända försiktigt.
- Tillsätt 1 ml av kalcein AM märkt blod i 10 - 1,5 ml mikrorör. Lägg till GPIIb / IIIa-hämmare antikropp till varje på önskad utspädning (molekylvikt IgG ~ 150kDa). Ett exempel spädningsserier är från 1200nM till 9nM och inkluderar ett nej antikropp-kontroll och en oberoende antikropp kontroll. En utmärkt positiv kontroll för inhibition skulle REOPRO (abciximab, Eli Lilly) vid en koncentration av 20ug/ml. Blanda genom att vända försiktigt.
- Inkubera vid rumstemperatur i 1 timme. Blanda genom att vända försiktigt var 10 minut.
Del 3: Köra experimentet flödescellen på BF1000 arbetsstationen.
- Först måste man sätta upp ett automatiserat protokoll i BioFlux styrmodul. För kollagen jag, bör man upprätta ett protokoll för att köra 10dyn/cm 2 för 10 minuter från uttaget väl. På denna punkt bör man också inrätta datainsamlingssystem parametrar med BF1000 arbetsstationen, inklusive kanal positioner, fånga i FITC våglängd och time-lapse information. Det rekommenderas att fånga 3 synfält med en 10x mål per kanal var 30 sekunder under en period av 10 minuter totalt.
- Arbeta snabbt, platsen 500ul preparerade blod av varje villkor i separata förberedda kanaler. Placera inget blod antikropp-kontroll till en kanal som är belagda med kollagen och en som bara är blockerad.
- Placera gränssnittet på tallriken.
- Placera plattan på BF1000 arbetsstationen mikroskop. Kläm på gränssnittet.
- Utför justering tallrik belastning. Dessutom, flytta scenen till en väl innehåller blod. Ställ FTIC Bildinsamling parametrar (exponeringstid, vinst osv ...).
- I BioFlux montage mjukvaran, starta förvärvet att börja flöda och förvärv samtidigt.
- Avlägsna plattan från BF1000 arbetsstation, avyttra plåt enligt lokala riktlinjer.
Del 4: representativa resultat.
Här protokoll för trombocyt adhesion och aggregation i mikroflödessystem kanaler presenterades. Behandling med en trombocytaggregation hämmare var anti-GPIIb/IIIa också med i protokollet. Använda kollagen belagda mikroflödessystem kanaler av BioFlux systemet bör man förvänta sig att se aggressiv blodproppar bildas över tid med obehandlad kontroll blodprov och inga blodproppar bildas på obestruket kanalen. I ett nyligen utfört experiment var den genomsnittliga storleken på aggregaten under kontroll förhållanden 2000μm 2.
Figur 1. 
Aktivt GPIIb / IIIa är potent mediator för trombocyt-trombocyt interaktion och aggregering stabilisering 1. Vidhäftning till kollagen aktiverar GPIIb / IIIa-komplex för att få fram detta svar 2. Efter inkubation med anti-GPIIb/IIIa i 1 timme innan för att klippa exponering bör man förvänta sig att se en minskning i storlek på tromboser samt en minskning i frekvensen av blodproppar bildas. En dosberoende respons kan normalt observeras vid 10dyn/cm 2.
Figur 2. 
IC 50 värdet för denna inhibitor 17nM på 10 dyn / cm 2. Maximal hämning (för detta donator) jämfört med om inga antikroppar kontroll var 11% vid 10 dyn / cm 2.
Medan de metoder som här presenterades med en specifik extracellulärt matrix protein och en specifik hämmare av trombocytaggregation, men protokollet utdragbar till andra ytbeläggningar, andra celltyper och andra hämmare för analyser celladhesion. De viktigaste ingredienserna till framgång av dessa experiment kan undvika bubblor i mikroflödessystem kanaler, korrekt utspädning av alla reagenser i rätt spädningsvätskor, och lämpliga villkor inkubationstiden för alla reagenser.
Discussion
Medan de metoder som här presenterades med en specifik extracellulärt matrix protein och en specifik hämmare av trombocytaggregation, men protokollet utdragbar till andra ytbeläggningar, andra celltyper och andra hämmare för analyser celladhesion. De viktigaste ingredienserna till framgång av dessa experiment kan undvika bubblor i mikroflödessystem kanaler, korrekt utspädning av alla reagenser i rätt spädningsvätskor, och lämpliga villkor inkubationstiden för alla reagenser.
Disclosures
De bidragande författarna är anställda av Fluxion Biosciences.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen I, Bovine | Reagent | Invitrogen | A1064401 | other sources of collagen I can be used |
| PBS plus Ca/Mg | Reagent | Invitrogen | 14040-117 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Reagent | EMD Millipore | EM-2930 Bottom of Form | From VWR |
| calcein AM | Reagent | Invitrogen | C1430 | Calcein AM from BD can also be used |
| BioFlux 1000 System | Reagent | Fluxion Biosciences | Contact Company | |
| BioFlux Plate | Reagent | Fluxion Biosciences | 900013 | |
| antiGPIIb/IIIa | Reagent | Abcam | ab33407 | an alternative # is ab15021 |
| ReoPro | Reagent | Eli Lilly | by Rx only |
References
- Jackson, S. P. The growing complexity of platelet aggregation. Blood. 109, 5087-5095 (2007).
- Nakamura, T., Kambayashi, J., Okuma, M., Tandon, N. N. Activation of the GP IIb-IIIa complex induced by platelet adhesion to collagen is mediated by both alpha2beta1 integrin and GP. VI. J Biol Chem. 274, 11897-11903 (1999).
