Summary
هذا الإجراء يوضح كيفية استخدام الجينات electroporation MXcell بولسير النظام بسرعة وبسهولة تحديد أفضل الظروف لelectroporation الليفية الماوس الجنينية (MEFs) أو الخلايا الأولية الأخرى. وتناقش أيضا اعتبارات المشاكل المرتبطة في شريط الفيديو.
Abstract
أصبح من الواضح بشكل متزايد أن electroporation هي الطريقة الأكثر فعالية لإدخال الحمض النووي البلازميد أو سيرنا داخل الخلايا الأولية. وضعت خصيصا لجين electroporation MXcell بولسير النظام والعازلة جين electroporation بولسير (بيو راد) لtransfect بسهولة الأحماض النووية في خلايا الثدييات والتي يصعب transfect الخلايا ، مثل الخلايا الجذعية الأولية و. سوف نقوم شرح كيفية إجراء تجربة بسيطة لتحديد أفضل الظروف بسرعة electroporation. سوف نقوم شرح كيفية تشغيل عدة عينات من خلال مجموعة من الشروط electroporation بحيث يمكن إجراء تجربة في نفس الوقت الذي يتم تنفيذ التحسين. وسوف نعرض أيضا كيفية تحديد الظروف المثلى باستخدام 96 - جيدا لوحات electroporation يمكن استخدامها مع cuvettes electroporation القياسية ، وتسهيل الانتقال من لوحات لelectroporation cuvettes electroporation مع الحفاظ على كفاءة electroporation نفسه. في الفيديو ، وسوف نناقش أيضا بعض العوامل الرئيسية التي يمكن أن تؤدي إلى نجاح أو فشل التجارب electroporation.
Protocol
1) إعداد خلية
- عند استخدام الخلايا الملتصقة ، فمن الضروري أن يعرض للتريبسين وجمع الخلايا قبل electroporation.
- للمقارنة بين الاربعة ترنسفكأيشن الماوس الجنينية الثقافات (MEF) الليفية ، وهو ما يمثل ثلاثة أرقام مرور مختلفة ، نفذ ما يلي على كل قارورة.
- نضح خارج وسائل الإعلام ثقافة الخلية.
- إضافة إلى برنامج تلفزيوني غسل الخلايا.
- إزالة برنامج تلفزيوني ، إضافة التربسين كافية لتغطية الخلايا ، وانتظر بضع دقائق للسماح التربسين لفصل الخلايا.
- التحقق من قوارير تحت المجهر للتحقق من حالة من الخلايا ، صفعة لفصل الخلايا القارورة ، ومن ثم تحقق القارورة مرة أخرى لجعل وفصل جميع خلايا بالتأكيد.
- الانتظار وقتا إضافيا وكرر إذا لزم الأمر.
- حالما يتم فصل كل الخلايا ، إضافة إلى مصل وسائل الإعلام التي تحتوي على تحييد التربسين.
- نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي ، والخلايا بواسطة الطرد المركزي بيليه (RCF = 300 x ج)
- إزالة الخلايا وطاف resuspend في حجم معروف من برنامج تلفزيوني.
- عدد الخلايا.
- نقل إلى أنبوب جديد لحجم مناسب لتعليق خلية لتوفير العدد المطلوب من الخلايا لإجراء التجارب (سوف تحتاج 150 ميكرولتر من الخلايا في البئر على كثافة 1 × 10 6 خلية / مل).
- الطرد المركزي الخلايا.
- إزالة الخلايا وطاف resuspend في حجم مناسب من الجينات electroporation بولسير العازلة لتحقيق الكثافة خلية من 1 × 10 6 خلية / مل.
- إضافة 20 ميكروغرام لكل مليلتر من البلازميد التعليق الخلية والمزيج بلطف.
2) إعداد السفينة وElectroporation electroporation
الإعداد لوحة وelectroporation
- توصيل لوحة في غرفة وحدة السلطة من نظام بولسير جين electroporation MXcell.
- ماصة 150 ميكرولتر خليط الخلية أو المخزن في آبار لوحة electroporation 96 - جيدا.
- وضع لوحة في لوحة الغرفة والنبض.
- إزالة لوحة من الغرفة.
- مزيج جيد من قبل محتويات pipetting صعودا وهبوطا في كل بئر.
- نقل الخلايا من كل بئر إلى ما قبل عازلة في درجة حرارة 12 - جيدا لوحات.
- اضغط على لوحة لتوزيع الخلايا ووضعها في الحاضنة.
- اسمحوا استعادة الخلايا لمدة 24 ساعة.
كفيت والإعداد electroporation
- توصيل لوحة الغرفة من وحدة الطاقة التابعة لمنظومة بولسير جين electroporation MXcell والمكونات في ShockPod ™ كفيت الغرفة.
- ماصة 600 ميكرولتر من خلية الى تعليق كفيت الطول 0.4 electroporation الفجوة.
- كفيت وضعت في غرفة ShockPod وتسليم نبض الكهربائية.
- إزالة كفيت من الغرفة.
- مزيج محتويات كفيت بواسطة pipetting صعودا وهبوطا في كفيت.
- نقل الخلايا من كل بئر إلى ما قبل عازلة في درجة حرارة 12 - جيدا لوحات.
- اضغط على لوحة لتوزيع الخلايا ووضعها في الحاضنة.
- السماح للخلايا استعادة لمدة 24 ساعة.
نتائج الممثل 3)
بعد transfecting الخلايا ويسمح لهم باسترداد ، وتحليل كفاءة ترنسفكأيشن نوعيا ، وذلك باستخدام المجهر epifluorescent ، والكمية ، وذلك باستخدام التدفق الخلوي.
الشكل 1. الخلايا التي تم electroporated بنجاح والآن يعبرون عن الجين GFP تظهر تحت المجهر epifluorescent.
الشكل 2. الشخصية الخلايا تحت النقيض من مرحلة التصور يسمح للخلايا كلا transfected وuntransfected. هذه هي الخلايا التي تعرضت لنبض أدنى جهد في electroporation 200V. كانت الخلايا متموجة إلى حد كبير نظرا للكثافة العالية الخلية.
الشكل 3. الحقل نفسه تحت نظر epifluorescence يظهر عددا من الخلايا يعبرون عن علامة GFP ، ولكن هذه ليست سوى نسبة صغيرة من الخلايا مرئية في الصورة السابقة.
الشكل 4. وفي 250V ، فإن العدد الكلي للخلايا حية تحت المقابل شهدت انخفاضات طفيفة المرحلة.
الشكل 5. epifluorescence كيل ، يمكن للمرء أن يرى أن عددا من الخلايا معربا عن GFP قد ازداد.
الشكل 6. وفي أعلى الجهد تطبيقها ، 375V ، هناك عدد أقل من خلايا حية مرئية.
الشكل 7 ، ولكن نسبة كبيرة من الخلايا المتبقية يعبرون عن GFP. الشرط الأمثل الذي يعتمد على التصميم التجريبي. في بعض التجارب قد لأكبر عدد من الخلايا transfected يكون الأمثل ، في التجارب الأخرى ترنسفكأيشن أعلى نسبة قد تكون أفضل.
ونحن مهتمون في نسبة الخلايا التي يتم GFP إيجابية تحت كل حالة ، وكيف تختلف النسب المئوية مع التقدم في العمر الخلية. التدفق الخلوي يمكن توفير معلومات كمية عن نتائج ترنسفكأيشن تحت كل الظروف electroporation مختلفة.
الشكل 8 ، وهنا نسبة الخلايا التي يتم GFP الإيجابية في مرور 5 يتم عرض الخلايا تحت كل الظروف electroporation 12. النسبة القصوى ترنسفكأيشن كان ما يقرب من 80 ٪ تحت نبض الجهد تسوس أعلى الأسي ، حالة 6 ، و 70 ٪ في ظل موجة النبض أقوى اختبار مربع ، حالة 12.
الرقم 9. ومع مرور الخلايا 9 مرات قبل electroporation ، والنمط العام لنسبة ترنسفكأيشن غير متطابقة تقريبا ، ولكن مع انخفاض طفيف جدا في نسبة ترنسفكأيشن.
الرقم 10. المعروضة هنا هي النسب المئوية للخلايا في GFP مرور 13 الخلايا التي تظهر انخفاضا ملحوظا في نسبة ترنسفكأيشن نسبة إلى أصغر الخلايا. وكانت أعلى النسب المئوية ترنسفكأيشن ما يقرب من نصف ما تم تحقيقه مع الخلايا الأصغر سنا مما يدل على أهمية استخدام الخلايا السليمة في أقرب وقت ممكن بعد العزلة.
| شروط Electroporation المستخدمة لخلايا MEF transfecting باستخدام الجينات بولسير MXcell | ||
| الشرط (1-6) البقول تسوس الأسي ، مع كل 350 UF ، 1000ohm | الجهد (V) | |
| 1 | 200 | |
| 2 | 250 | |
| 3 | 300 | |
| 4 | 326 | |
| 5 | 350 | |
| 6 | 376 | |
| الشرط (7-12) البقول مربع الموج ، مع كل UF 2000 ، أوم 1000 ، ونبض 1 | الجهد (V) | نبض المدة (مللي ثانية) |
| 7 | 200 | 10 |
| 8 | 250 | 10 |
| 9 | 300 | 10 |
| 10 | 200 | 20 |
| 11 | 250 | 20 |
| 12 | 300 | 20 |
Discussion
هذه المقالة فيديو يوضح كيفية استخدام نظام electroporation MXcell من التعرف بسهولة electroporation الظروف المثلى لMEFs أو غيرها من خطوط الخلايا الأولية. شكل لوحة 96 - جيدا يسمح لكثير من الظروف التجريبية متماثلة أو التحسين التي سيتم تنفيذها في وقت واحد ، والتي يمكن للقضاء على الحاجة لاجراء تجارب عديدة منفصلة. في حين أن تنفيذ هذا الإجراء ، ينبغي للمرء أن نتذكر أن استخدام الخلايا السليمة في أقرب وقت ممكن بعد عزل واستخدام electroporation الظروف التي تتناسب مع المنطقة العازلة electroporation.
Disclosures
ويعمل المؤلفون من خلال بيو راد مختبرات التي تنتج الكواشف والأداة المستخدمة في هذه المقالة
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser® Electroporation Buffer | Bio-Rad | 165-2676 | |
| Gene Pulser MXcell™ Electroporation System | Bio-Rad | 165-2670 | |
| Gene Pulser MXcell™ ShockPod™ Cuvette Chamber | Bio-Rad | 165-2673 | |
| Gene Pulser MXcell™ Electroporation System With ShockPod™ Cuvette Chamber | Bio-Rad | 165-2674 |
