Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

Summary

Dieses Verfahren zeigt, wie die Gene Pulser MXcell Elektroporation System nutzen, um schnell und einfach identifizieren die besten Bedingungen für die Elektroporation embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) oder andere Primärzellen. Überlegungen zur Fehlerbehebung sind auch in den zugehörigen Video diskutiert.

Abstract

Es wird immer deutlicher, dass die Elektroporation der effektivste Weg, um Plasmid-DNA oder siRNA in primären Zellen einzuführen. Die Gene Pulser MXcell Elektroporation und Gene Pulser Elektroporation Puffer (Bio-Rad) wurden speziell entwickelt, um leicht transfizieren Nukleinsäuren in Säugerzellen und schwer zu transfizieren Zellen, wie Primär-und Stammzellen. Wir werden zeigen, wie man ein einfaches Experiment, um schnell die besten Elektroporation Bedingungen durchzuführen. Wir werden zeigen, wie man mehrere Proben durch eine Reihe von Elektroporation Bedingungen, so dass ein Experiment zur gleichen Zeit wie die Optimierung durchgeführt wird, kann durchgeführt werden, laufen. Wir werden auch zeigen, wie optimale Bedingungen identifiziert mit 96-well Platten Elektroporation können mit Standard-Elektroporationsküvetten verwendet werden, erleichtert die Umstellung von Elektroporation Platten Elektroporationsküvetten unter Beibehaltung der gleichen Elektroporation Effizienz. In dem Video werden wir auch diskutieren einige der wichtigsten Faktoren, die zum Erfolg oder Misserfolg der Elektroporation Experimente führen kann.

Protocol

1) Zellpräparation

1. Bei der Verwendung von anhaftenden Zellen, ist es notwendig, trypsinize und sammeln die Zellen vor der Elektroporation.
2. Zum Vergleich Transfektion unter den vier embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Kulturen, die drei anderen Stelle Zahlen, gehen Sie wie folgt auf jeder Flasche.
3. Absaugen Zellkulturmedien.
4. Add PBS, um Zellen zu waschen.
5. Entfernen PBS; add ausreichend Trypsin, um Zellen bedecken und einige Minuten warten, damit Trypsin, um Zellen zu lösen.
6. Überprüfen Sie Flaschen mit einem Mikroskop, um den Zustand der Zellen zu überprüfen, smack Kolben auf Zellen zu trennen, und dann überprüfen Kolben erneut, um sicherzustellen Zellen sind alle gelöst.
7. Warten Sie zusätzlich Zeit und bei Bedarf wiederholen.
8. Wenn alle Zellen abgelöst werden, fügen Serum mit Medien Trypsin zu neutralisieren.
9. Transfer-Zellen in ein Zentrifugenröhrchen und Pellet-Zellen durch Zentrifugation (RZB = 300 xg).
10. Überstand entfernen und die Zellen in einem bekannten Volumen von PBS.
11. Zählen von Zellen.
12. Transfer in ein neues Röhrchen das entsprechende Volumen der Zellsuspension die erforderliche Anzahl von Zellen für Experimente (Sie werden 150 ul Zellen pro Vertiefung in einer Dichte von 1 x 10 ⁶ Zellen / ml benötigen) liefern können.
13. Centrifuge Zellen.
14. Überstand entfernen und die Zellen in dem entsprechenden Volumen Gene Pulser Elektroporationspuffer auf eine Zelldichte von 1 x 10 ⁶ Zellen / ml erreichen.
15. Add 20 ug von Plasmid pro ml Zellsuspension und vorsichtig mischen.

2) Die Elektroporation Schiff Setup und Elektroporation

Platte Setup und Elektroporation

1. Steckerplatte Kammer in den Leistungsteil des Gene Pulser MXcell Elektroporation System.
2. Je 150 ul Zellgemisch oder Puffer in die Vertiefungen einer 96-well Platte Elektroporation.
3. Legen Sie Platte in Platte Kammer und Puls.
4. Entfernen Platte aus der Kammer.
5. Gut mischen Inhalte durch Auf-und Abpipettieren in jede Vertiefung.
6. Übertragen Sie die Zellen aus jedem gut vorgewärmten Puffer in 12-Well-Platten.
7. Tippen Sie auf Teller verteilen Zellen und steckte es in Inkubator.
8. Lassen Zellen für 24 Stunden zu erholen.

Cuvette Setup und Elektroporation

9. Ziehen Sie Lamellenraum aus dem Leistungsteil des Gene Pulser MXcell Elektroporation System und stecken Sie den ShockPod ™ Küvette Kammer.
10. Pipette 600 ul Zellsuspension in ein 0,4 cm Abstand Elektroporationsküvette.
11. Put Küvette in ShockPod Kammer und liefern elektrischen Impuls.
12. Entfernen Küvette aus der Kammer.
13. Mix Küvette Inhalte durch Auf-und Abpipettieren in Küvette.
14. Übertragen Sie die Zellen aus jedem gut vorgewärmten Puffer in 12-Well-Platten.
15. Tippen Sie auf Teller verteilen Zellen und steckte es in Inkubator.
16. Lassen Sie die Zellen für 24 Stunden zu erholen.

3) repräsentative Ergebnisse

Nach Transfektion von Zellen und erlaubt ihnen, Wiederherstellung, Analyse der Transfektionseffizienz qualitativ mit Epifluoreszenzmikroskopie und quantitativ mit Hilfe der Durchflusszytometrie.

Abbildung 1. Cells, die erfolgreich elektroporiert und sind nun Ausdruck des GFP-Gens erscheinen unter Epifluoreszenzmikroskopie.

Abbildung 2. Anzeigen der Zellen unter Phasenkontrast ermöglicht die Visualisierung der beiden transfizierten und nicht transfizierten Zellen. Dies sind die Zellen, die die niedrigste Spannung Elektroporation Puls bei 200 V ausgesetzt waren. Die Zellen sind weitgehend konfluenten aufgrund der hohen Zelldichte.

Abbildung 3. Das gleiche Sichtfeld unter Epifluoreszenz zeigt eine Anzahl von Zellen sind Ausdruck der GFP-Marker, aber diese sind nur ein kleiner Prozentsatz der Zellen sichtbar in dem vorhergehenden Bild.

Abbildung 4. Bei 250V, verringert sich die Gesamtzahl der lebenden Zellen unter Phasenkontrast gesehen leicht.

Abbildung 5. Under Epifluoreszenz, kann man sehen, dass die Anzahl der GFP exprimierenden Zellen erhöht hat.

Abbildung 6. Auf der höchsten Spannung, 375V, gibt es weniger lebende Zellen sichtbar.

Abbildung 7. Allerdings sind ein Großteil der restlichen Zellen, die GFP. Welche Bedingung ist optimal, hängt von den experimentellen Design. In einigen Experimenten wurde die größte Anzahl an transfizierten Zellen könnte optimal sein, in anderen Experimenten der höchste Prozentsatz der Transfektion wohl am besten sein.

Wir interessieren uns für den Prozentsatz an Zellen, die GFP positive unter jeder Bedingung und wie die Prozentsätze variieren mit Zell-Alter sind. Die Durchflusszytometrie kann liefern quantitative Information über die Transfektion Ergebnisse, die unter jedem der verschiedenen Elektroporation Bedingungen.

Abbildung 8. Hier ist der Anteil der Zellen, die GFP positive in den Kanal 5 Zellen unter jedem der 12 Elektroporation Bedingungen gezeigt werden. Die maximale Transfektion Anteil von ca. 80% unter der höchsten Spannung exponentiellen Abfall Puls, Zustand 6, und 70% unter dem stärksten Rechteckimpuls getestet, Zustand 12.

Abbildung 9. Mit der Zellen weitergegeben 9 Mal vor der Elektroporation, das allgemeine Muster der Transfektion Prozentsatz nahezu identisch ist, aber mit einem sehr leichten Rückgang der Transfektion Prozentsätze.

Abbildung 10. Sehen Sie hier die Anteile der GFP-Zellen in der Passage 13 Zellen, die zu einem deutlichen Rückgang in der Transfektion Prozentsatz im Vergleich zu den jüngeren Zellen zeigen. Die höchsten Prozentsätze wurden Transfektion etwa die Hälfte, was mit den jüngeren Zellen demonstriert die Bedeutung der Verwendung gesunden Zellen so bald nach der Isolierung wie möglich erreicht.

Elektroporation Bedingungen für die Transfektion von MEF-Zellen mit dem Gene Pulser MXcell verwendet
Zustand (1-6) Exponentiellen Abfall Impulse, alle mit 350 uF, 1000OHM	Spannung (V)
1	200
2	250
3	300
4	326
5	350
6	376
Condition (7-12) Rechteckimpulse, Alle mit 2000 uF, 1000 ohm, und 1 Impuls	Spannung (V)	Impulsdauer (ms)
7	200	10
8	250	10
9	300	10
10	200	20
11	250	20
12	300	20

Discussion

Dieses Video Artikel beschreibt, wie die MXcell Elektroporation System nutzen, um leicht zu identifizieren optimale Bedingungen für die Elektroporation MEFs oder andere primäre Zelllinien. Die 96-Well-Platte-Format ermöglicht für viele Wiederholungen der experimentellen oder Optimierung Bedingungen gleichzeitig durchgeführt werden, wodurch die Notwendigkeit für viele einzelne Experimente, beseitigen können. Während der Durchführung dieses Verfahrens, sollte man daran denken, gesunde Zellen so bald nach der Isolierung wie möglich zu nutzen und Elektroporation Bedingungen, die zur Elektroporationspuffer abgestimmt sind zu verwenden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gene Pulser® Electroporation Buffer	Bio-Rad	165-2676
Gene Pulser MXcell™ Electroporation System	Bio-Rad	165-2670
Gene Pulser MXcell™ ShockPod™ Cuvette Chamber	Bio-Rad	165-2673
Gene Pulser MXcell™ Electroporation System With ShockPod™ Cuvette Chamber	Bio-Rad	165-2674