高効率で初代培養細胞をトランスフェクトするためにジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムの使用

Summary

この手順では、迅速かつ簡単に、マウス胚繊維芽細胞（MEF）や他の主要な細胞のために最高のエレクトロポレーション条件を識別するためにジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムを使用する方法を示します。トラブルシューティングのための考慮事項は、関連するビデオで説明しています。

Abstract

それは、エレクトロポレーションは、プライマリ細胞にプラスミドDNAやsiRNAを導入するための最も効果的な方法であることがますます明らかになってきている。ジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムとジーンパルサーのエレクトロポレーション緩衝液（Bio - Rad社）は、特に簡単に哺乳動物の細胞や、プライマリおよび幹細胞のような困難なトランスフェクション細胞に核酸をトランスフェクトするために開発されました。我々はすぐに最高のエレクトロポレーション条件を識別する簡単な実験を実行する方法を説明します。我々は最適化が実行されると実験を同時に実施できるように、エレクトロポレーション条件の範囲でいくつかのサンプルを実行する方法について説明します。我々はまた、同じエレクトロポレーション効率を維持しながら、最適な条件は、標準的なエレクトロポレーションキュベットで使用できる96ウェルエレクトロポレーションプレートを使用してエレクトロポレーションキュベットにエレクトロプレートからスイッチを容易に識別方法を紹介します。ビデオでは、我々はまた、エレクトロポレーション実験の成功または失敗につながることができる重要な要因のいくつかを議論します。

Protocol

1）細胞調製

1. 接着細胞を使用する場合、それはトリプシンおよびエレクトロポレーションする前に細胞を収集することが必要です。
2. つの異なる継代数を表す4つのマウス胚性線維芽細胞（MEF）の文化、間のトランスフェクションを比較するために、各フラスコに、以下を実行します。
3. 細胞培養培地をオフに吸引除去する。
4. 細胞を洗浄するためにPBSを追加。
5. PBSを取り外し、セルをカバーするのに十分なトリプシンを追加し、トリプシンで細胞を剥離できるように数分待ちます。
6. 、細胞の状態を確認するための顕微鏡とフラスコをチェックして細胞を分離するためにフラスコを放つし、細胞がすべて取り外されていることを確認するために再びフラスコを確認してください。
7. 必要に応じて追加の時間と繰り返しを待つ。
8. すべてのセルがデタッチされると、トリプシンを中和する血清含有培地を加える。
9. 遠心チューブに細胞を移し、遠心分離により細胞をペレット化（RCF = 300 × g）で。
10. PBSの既知の量で上清と再懸セルを削除します。
11. 細胞を数える。
12. 細胞懸濁液の適切な量は、実験用のセル（あなたが1 × 10 ⁶細胞/ mLの密度で、ウェル当たりの細胞を150μLが必要になります）、必要な数を提供するために、新しいチューブに移す。
13. 細胞を遠心分離します。
14. 1 × 10 ⁶細胞/ mLの細胞密度を達成するためにジーンパルサーのエレクトロポレーションバッファーの適切な量で上清と再懸セルを削除します。
15. 細胞懸濁液のプラスミド1mLあたり20μgのを加え、穏やかに混ぜる。

2）エレクトロポレーション容器のセットアップとエレクトロポレーション

プレートのセットアップとエレクトロポレーション

1. ジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムの電源モジュールにプラグプレートチャンバー。
2. 96ウェルエレクトロプレートのウェルにピペット150μLの細胞の混合物またはバッファー。
3. プレートチャンバーとパルスにプレートを置く。
4. チャンバーからプレートを取り外します。
5. 各ウェルにピペッティングでよく内容を混ぜる。
6. 各ウェルから12ウェルプレートに予め温めておいたバッファーに細胞を移す。
7. 細胞を分散し、インキュベーターでそれを置くためにプレートをタップします。
8. 細胞は24時間で回復しましょう​​。

キュベットのセットアップとエレクトロポレーション

9. ShockPodのジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムとプラグ™キュベットチャンバーの電源モジュールからプレートチャンバーを外してください。
10. ピペット0.4センチメートルギャップのエレクトロポレーションキュベットに細胞懸濁液600μL。
11. ShockPodチャンバー内にキュベットを入れ、電気パルスを提供します。
12. チャンバーからキュベットを削除します。
13. キュベット内で上下にピペッティングによりキュベットの内容を混ぜる。
14. 各ウェルから12ウェルプレートに予め温めておいたバッファーに細胞を移す。
15. 細胞を分散し、インキュベーターでそれを置くためにプレートをタップします。
16. 細胞は24時間で回復しましょう​​。

3）代表者の結果

細胞をトランスフェクトし、それらを回復させた後、フローサイトメトリーを用いて、定量的に落射蛍光顕微鏡法を用いて、定性的にトランスフェクション効率を分析し、そして。

成功エレクトロされ、現在はGFPの遺伝子を発現している図1。細胞は落射蛍光顕微鏡法の下に表示されます。

図2。位相コントラストでセルの表示は、トランスフェクションし、トランスフェクトされていない両方の細胞を可視化できる。これらは、200Vで最も低い電圧の電気パルスに曝された細胞である。細胞が原因で、高い細胞密度に大きくコンフルエントです。

図3。落射蛍光下のビューの同じフィールドには、細胞がGFPマーカーを発現している数を示していますが、これらは前の画像に表示されているセルのうちのごく少数です。

図4。250Vで、位相コントラストで見て生きている細胞の総数はわずかに減少する。

図5は、。落射蛍光の下で、一つはGFP発現細胞の数が増加していることがわかります。

図6。最高電圧印加、375Vで、目に見えるが少なく生きた細胞があります。

図7。しかし、残りの細胞の大部分は、GFPを発現している。最適となる条件は、実験の設計に依存します。いくつかの実験でトランスフェクトされた細胞の最大数は、他の実験で最も高い割合のトランスフェクションが最良かもしれない、最適となります。

私たちは、それぞれの条件の下でGFP陽性とどのようにパーセントは細胞年齢とともに変化するセルの割合に興味を持っています。フローサイトメトリーは、別のエレクトロポレーション条件のそれぞれの下でトランスフェクションの結果に関する定量的情報を提供することができます。

図8。ここでは12エレクトロポレーション条件のそれぞれの下に5個の細胞が示されている通路に正のGFPである細胞の割合。最大トランスフェクションの割合は、最強の方形波パルスの下で最も高い電圧指数減衰パルス、状態6、および70％の下で約80％が、条件12をテストした。

図9。細胞では、エレクトロポレーションの前に9回を渡された、トランスフェクションの割合の全体的なパターンはほとんど同じですが、トランスフェクションの割合で非常にわずかな減少で。

図10。ここに示されているのは継代の若い細胞に比べてトランスフェクションの割合の著しい減少を示し13細胞におけるGFP細胞のパーセンテージです。最高のトランスフェクションの割合は、できるだけ早く分離した後、健康な細胞を使用することの重要性を実証する若い細胞で達成されたものを約半分であった。

ジーンパルサーMXcellを使用してMEF細胞をトランスフェクトするために使用されるエレクトロポレーション条件
条件（1-6） 指数減衰パルス、 1000ohm 350 uFのあるすべての、	電圧（V）
1	200
2	250
3	300
4	326
5	350
6	376
条件（7-12） 方形波パルス、 2000 UF、1000オーム、および1パルスを持つすべての	電圧（V）	パルス持続時間（ミリ秒）
7	200	10
8	250	10
9	300	10
10	200	20
11	250	20
12	300	20

Discussion

このビデオの記事では、簡単にMEFのその他の一次細胞株に対して最適なエレクトロポレーション条件を識別するためMXcellのエレクトロポレーションシステムを使用する方法を示します。多くは多くの独立した実験の必要性をなくすことができる、同時に実行される実験や最適化条件の複製のために96ウェルプレートフォーマットが可能です。この手順を行いながら、一つはできるだけ早く分離後の健康な細胞を使用するとエレクトロポレーションバッファーに一致しているエレクトロポレーション条件を使用することを忘れないようにすべき。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gene Pulser® Electroporation Buffer	Bio-Rad	165-2676
Gene Pulser MXcell™ Electroporation System	Bio-Rad	165-2670
Gene Pulser MXcell™ ShockPod™ Cuvette Chamber	Bio-Rad	165-2673
Gene Pulser MXcell™ Electroporation System With ShockPod™ Cuvette Chamber	Bio-Rad	165-2674