Summary
הליך זה מראה כיצד להשתמש ג'ין Pulser מערכת MXcell electroporation במהירות ובקלות לזהות את התנאים הטובים ביותר עבור electroporation fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) או תאים ראשוניים אחרים. שיקולים לפתרון בעיות הם דנו גם וידאו המשויכת.
Abstract
זה הופך ברור יותר ויותר כי electroporation היא הדרך היעילה ביותר להציג את ה-DNA או פלסמיד siRNA לתוך תאים ראשוניים. Pulser הגן מערכת MXcell electroporation וג'ין Pulser electroporation חיץ (Bio-Rad) פותחו במיוחד בקלות transfect חומצות גרעין לתאי יונקים קשות transfect תאים, כגון תאים ראשוניים גזע. אנו מדגימים כיצד לבצע ניסוי פשוט לזהות במהירות את התנאים electroporation הטוב ביותר. נדגים איך לנהל מספר דוגמאות באמצעות מגוון של תנאים electroporation כך ניסוי ניתן לבצע באותו זמן כמו אופטימיזציה מבוצעת. אנו גם להראות כיצד תנאים אופטימליים מזוהה באמצעות 96-היטב צלחות electroporation ניתן להשתמש cuvettes electroporation סטנדרטי, הקלת לעבור צלחות electroporation כדי cuvettes electroporation תוך שמירה על יעילות electroporation אותו. בסרטון, אנו ידונו גם כמה גורמי מפתח שיכולים להוביל להצלחה או כישלון של ניסויים electroporation.
Protocol
1) תא הכנה
- בעת שימוש בתאי חסיד, יש צורך trypsinize לאסוף את התאים לפני electroporation.
- כדי להשוות transfection בין ארבעת עובריים בעכבר פיברובלסטים (MEF) תרבויות, המייצג שלושה מספרים מעבר שונות, לבצע את הפעולות הבאות על כל בקבוק.
- לשאוב את תרבות התקשורת הסלולרי.
- הוסף PBS לשטוף את התאים.
- הסר PBS; להוסיף טריפסין מספיק כדי לכסות תאים, לחכות כמה דקות כדי לאפשר טריפסין לנתק את התאים.
- בדוק צלוחיות עם מיקרוסקופ כדי לוודא את מצבם של התאים, הרואין בקבוק לנתק את התאים, ולאחר מכן לבדוק שוב בקבוק להפוך תאים בטוח מנותקים מכל.
- חכו זמן נוסף וחזור במידת הצורך.
- לאחר כל התאים מנותקים, להוסיף מדיה המכילה סרום לנטרל טריפסין.
- העברת התאים צינור צנטריפוגות, ותאי גלולה ידי צנטריפוגה (RCF = 300 XG).
- הסרת תאים supernatant ו resuspend בנפח ידוע של PBS.
- ספירת תאים.
- מעבירים צינור חדש נפח מתאים של השעיה תאים סלולריים כדי לספק את המספר הדרוש של תאים לניסויים (תצטרך 150 μL של תאים לכל גם בצפיפות של 1 x 10 6 תאים / מ"ל).
- צנטריפוגה תאים.
- הסרת תאים supernatant ו resuspend בהיקף המתאים חיץ Pulser electroporation ג'ין להשיג צפיפות התאים של 1 x 10 6 תאים / מ"ל.
- הוסף 20 מ"ל של מיקרוגרם לכל פלסמיד ההשעיה תא ומערבבים בעדינות.
2) כלי electroporation ההתקנה electroporation
פלייט ההתקנה electroporation
- הצלחת הכנס לתוך תא מודול את הכוח של מערכת Pulser electroporation MXcell ג'ין.
- פיפטה 150 תא תערובת μL או חיץ לתוך בארות צלחת electroporation 96-היטב.
- שים צלחת בתא הצלחת הדופק.
- הסר את צלחת מ קאמרית.
- מערבבים היטב על ידי תוכן pipetting למעלה ולמטה גם כל אחד.
- העברת התאים מבאר כל למאגר מראש התחמם ב 12 גם הצלחות.
- הקש צלחת להפיץ תאים ושמתי אותו בחממה.
- בואו תאים להתאושש במשך 24 שעות.
קובט ההתקנה electroporation
- נתק קאמרית צלחת ממודול את כוחה של מערכת Pulser MXcell electroporation ג'ין וחבר ב ShockPod ™ קובט קאמרית.
- פיפטה 600 μL ההשעיה התא לתוך הפער קובט 0.4 ס"מ electroporation.
- שים קובט בתא ShockPod ולספק הדופק חשמלי.
- הסר קובט מבית הבליעה.
- מערבבים את תוכן קובט ידי pipetting למעלה ולמטה קובט.
- העברת התאים מבאר כל למאגר מראש התחמם ב 12 גם הצלחות.
- הקש צלחת להפיץ תאים ושמתי אותו בחממה.
- בואו התאים להתאושש במשך 24 שעות.
3) נציג תוצאות
לאחר transfecting התאים ומאפשר להם להחלים, לנתח את יעילות transfection איכותית, באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent ו כמותית, באמצעות cytometry הזרימה.
באיור 1. תאים שעברו electroporated בהצלחה וכעת הם המבטאים את הגן GFP מופיעים תחת מיקרוסקופ epifluorescent.
איור 2. צופה התאים תחת לעומת השלב מאפשרת ויזואליזציה של תאים הן transfected ו untransfected. אלה הם תאים שנחשפו את הדופק הנמוך ביותר electroporation המתח 200V. התאים ומחוברות בעיקר בשל צפיפות התאים גבוהה.
איור 3. אותו שדה הראייה תחת epifluorescence מראה מספר התאים מביעים את סמן ה-GFP, אבל אלה הם רק אחוז קטן של תאים גלויים בתמונה הקודמת.
איור 4. בשלב 250V, המספר הכולל של תאים חיים ראה תחת בניגוד שלב ירידות קלות.
איור 5. תחת epifluorescence, אפשר לראות כי מספר התאים GFP להביע גדל.
איור 6. במתח הגבוה ביותר מיושם, 375V, ישנם תאים חיים פחות גלוי.
איור 7. עם זאת, אחוז גדול של התאים הנותרים מביעים GFP. באיזה מצב הוא אופטימלי תלוי בתכנון הניסוי. בניסויים מסוימים את המספר הגדול ביותר של תאים transfected יכול להיות אופטימלי, בניסויים אחרים transfection האחוז הגבוה ביותר עשוי להיות הטוב ביותר.
אנו מעוניינים באחוז התאים GFP חיובית בתנאי אחד ואיך באחוזים משתנים עם הגיל התאים. Cytometry זרימת יכולים לספק מידע כמותי על תוצאות transfection תחת כל התנאים electroporation שונים.
איור 8. כאן את אחוז התאים ה-GFP חיובי במעבר 5 תאים תחת כל אחד מ -12 מצבים electroporation מוצגים. אחוז transfection המרבי היה כ -80% מתחת הדופק הגבוה מתח מעריכי ריקבון, מצב 6, ו -70% תחת הדופק החזק גל מרובע נבדק, מצבו 12.
איור 9. תאים עם עבר 9 פעמים לפני electroporation, את הדפוס הכללי של אחוז transfection כמעט זהה, אך עם ירידה קלה מאוד את אחוזי transfection.
איור 10. המוצג כאן הם אחוז התאים ה-GFP בקטע 13 תאים אשר מראים ירידה ניכרת באחוז transfection יחסית התאים צעירים יותר. האחוזים הגבוהים ביותר היו transfection כמחצית מה הושג עם תאים צעירים להפגין את החשיבות של שימוש בתאים בריאים מיד לאחר הבידוד ככל האפשר.
| Electroporation תנאי שימוש בתאי MEF transfecting באמצעות Pulser ג'ין MXcell | ||
| מצב (06/01) Decay פולסים מעריכי, כל עם 350 UF, 1000ohm | מתח (V) | |
| 1 | 200 | |
| 2 | 250 | |
| 3 | 300 | |
| 4 | 326 | |
| 5 | 350 | |
| 6 | 376 | |
| מצב (12/07) כיכר פולסים Wave, כל עם UF 2000, 1000 אוהם, ו 1 הדופק | מתח (V) | Pulse Duration (ms) |
| 7 | 200 | 10 |
| 8 | 250 | 10 |
| 9 | 300 | 10 |
| 10 | 200 | 20 |
| 11 | 250 | 20 |
| 12 | 300 | 20 |
Discussion
מאמר זה וידאו מדגים כיצד להשתמש במערכת electroporation MXcell לזהות בקלות electroporation תנאים אופטימליים MEFs או אחר שורות תאים ראשוניים. הפורמט 96-היטב צלחת מאפשר רבים משכפל של תנאי הניסוי או אופטימיזציה להתבצע בו זמנית, אשר יכול לבטל את הצורך בניסויים נפרדים רבים. בעת ביצוע הליך זה, יש לזכור להשתמש בתאים בריאים בהקדם לאחר הבידוד ככל האפשר להשתמש התנאים electroporation כי הם מתאימים למאגר electroporation.
Disclosures
המחברים הם מועסקים על ידי Bio-Rad Laboratories המייצרת ריאגנטים מכשיר שימוש במאמר זה
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser® Electroporation Buffer | Bio-Rad | 165-2676 | |
| Gene Pulser MXcell™ Electroporation System | Bio-Rad | 165-2670 | |
| Gene Pulser MXcell™ ShockPod™ Cuvette Chamber | Bio-Rad | 165-2673 | |
| Gene Pulser MXcell™ Electroporation System With ShockPod™ Cuvette Chamber | Bio-Rad | 165-2674 |
