고효율 기본 셀을 Transfect하는 진 Pulser Electroporation MXcell의 시스템을 사용하여

Summary

이 절차를 빠르게 쉽게 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs) 또는 기타 기본 세포에 가장 적합한 electroporation 조건을 식별하는 유전자 Pulser MXcell의 electroporation 시스템을 사용하는 방법을 보여줍니다. 문제 해결을위한 고려 사항도 관련 비디오 설명합니다.

Abstract

그것은 electroporation은 기본 세포에 플라스미드 DNA 또는 siRNA을 소개하는 가장 효과적인 방법임을 더욱 분명 해지고 있습니다. 진 Pulser MXcell의 electroporation 시스템과 진 Pulser의 electroporation 버퍼 (바이오 래드)은 특히 포유 동물 세포를 쉽게와 같은 기본 및 줄기 세포와 같은 어려운 transfect 세포로 핵산을 transfect하기 위해 개발되었습니다. 우리는 신속하게 최고의 electroporation 조건을 식별하는 간단한 실험을 수행하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 우리는 실험이 최적화가 수행 동시에 실시 할 수 있도록 electroporation 조건의 범위를 통해 몇 가지 샘플을 실행하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 우리는 또한 같은 electroporation 효율을 유지하면서 최적의 조건, 표준 electroporation의 cuvettes와 함께 사용할 수 있습니다 96 - 웰 플레이트 electroporation을 사용하여 electroporation의 cuvettes에 electroporation 플레이트의 스위치를 촉진 식별 방법을 보여줍니다. 동영상에서 우리는 electroporation 실험의 성공 또는 실패를 가져올 수있는 핵심 요소 중 일부를 설명합니다.

Protocol

1) 셀 준비

1. 자기편 세포를 사용하는 경우, 그것은 trypsinize과 electroporation하기 전에 세포를 수집하는 것이 필요합니다.
2. 세 가지 통로 번호를 나타내는 네 개의 마우스 배아 fibroblast (MEF) 문화 간의 transfection을 비교하려면 각각의 플라스크에서 다음을 수행합니다.
3. 세포 배양 매체를 대기음.
4. 세포를 씻어 PBS를 추가합니다.
5. PBS를 제거, 세포를 커버하는 충분한 트립신을 추가하고, 트립신은 세포를 분리 수 있도록 몇 분 기다리십시오.
6. , 세포의 상태를 확인하기 위해 현미경으로 flasks을 확인 세포를 분리 플라스크 갈기하고 있는지 세포가 모두 떨어뜨려하기 위해 다시 플라스크를 확인합니다.
7. 추가 시간과 반복 필요한 경우 기다립니다.
8. 모든 세포가 분리되면 트립신를 무력화하기 위해 혈청이 포함된 미디어를 추가할 수 있습니다.
9. 원심 분리기 튜브에 세포를 전송하고, 원심 분리에 의해 펠릿 세포 (RCF = 300 XG).
10. PBS의 유명한 볼륨에 뜨는 및 resuspend 세포를 제거합니다.
11. 세포를 세어보세요.
12. 세포 현탁액의 해당 볼륨이 실험을 위해 세포 (당신은 1 X 10 ⁶ 세포 / ML의 밀도에 잘 당 세포 150 μL가 필요합니다)의 필요한 숫자를 제공하는 새로운 튜브로 전송합니다.
13. 원심 분리기 세포.
14. 1 X 10 ⁶ 세포 / ML의 세포 밀도를 달성하기 위해 진 Pulser의 electroporation 버퍼의 해당 볼륨에 뜨는 및 resuspend 세포를 제거합니다.
15. 세포 현탁액의 플라스미드 당 ML 20 μg을 추가하고 부드럽게 섞는다.

2) Electroporation 선박 설정 및 electroporation

플레이트 설치 및 electroporation

1. 진 Pulser MXcell의 electroporation 시스템의 전원 모듈에 플러그 플레이트 챔버.
2. 피펫 150 μL 세포 혼합물 또는 96 - 웰 electroporation 판의 우물에 버퍼.
3. 플레이트 챔버 및 펄스의 접시를 넣어.
4. 챔버에서 플레이트를 제거합니다.
5. 각 우물에 위아래로 pipetting으로 잘 내용물을 섞는다.
6. 각 우물에서 12 잘 접시에 미리 예열 버퍼 세포를 전송합니다.
7. 세포를 배포하고 배양기에 넣어 접시 누릅니다.
8. 세포는 24 시간 동안 회복하자.

쿠베트 설정 및 electroporation

9. ShockPod의 유전자 Pulser MXcell의 electroporation 시스템 및 플러그 ™ 쿠베트 챔버의 전원 모듈에서 플레이트 챔버를 뽑습니다.
10. 0.4 cm 갑 electroporation의 쿠베트에 세포 현탁액의 피펫 600 μL.
11. ShockPod 챔버에 쿠베트를 넣고 전기 펄스를 제공합니다.
12. 챔버에서 쿠베트를 제거합니다.
13. 쿠베트에 아래 pipetting하여 쿠베트 내용을 섞는다.
14. 각 우물에서 12 잘 접시에 미리 예열 버퍼 세포를 전송합니다.
15. 세포를 배포하고 배양기에 넣어 접시 누릅니다.
16. 세포가 24 시간 동안 회복하자.

3) 대표 결과

세포를 transfecting하고 복구할 수있게되면, 유동세포계측법를 사용하여 양적 epifluorescent 현미경을 사용하여, 질적으로 transfection 효율을 분석합니다.

성공적으로 electroporated되었습니다 지금은 GFP 유전자를 표현 아르 그림 1. 세포는 epifluorescent 현미경 아래에 나타납니다.

그림 2. 위상 대조에서 세포를보기는 transfected와 untransfected 모두 세포의 시각화 수 있습니다. 이들은 200V의 낮은 전압 electroporation 펄스에 노출되었던 세포 수 있습니다. 세포 인해 높은 세포 밀도에 크게 합류하고 있습니다.

그림 3. epifluorescence 아래보기의 동일한 필드는 세포가 GFP 마커를 표현 아르의 숫자를 보여주지만, 이들은 이전의 이미지에서 보이는 세포의 단지 작은 비율입니다.

그림 4. 250V에서 위상 대조에 따라 본 사는 세포의 총 개수가 약간 줄어 듭니다.

epifluorescence에서 하나는 GFP 표현 세포의 수가 증가했다는 그림 5.보실 수 있습니다.

그림 6. 가장 높은 전압에서이 375V를 적용, 눈에 보이는 적은 라이브 세포가 없습니다.

그림 7. 그러나 남아있는 세포의 큰 비율 GFP를 표현하고 있습니다. 최적의 어떤 조건 것은 실험 설계에 따라 달라집니다. 어떤 실험에서 transfected 세포의 가장 큰 숫자는 다른 실험에서 가장 높은 비율 transfection이 최선이 될, 최적의 수 있습니다.

우리는 각각의 조건에 따라 긍정적인 GFP 방법과 비율이 세포 나이마다 다릅니다 세포의 비율에 관심이 있습니다. 유동세포계측법는 다른 electroporation 조건의 각에서 transfection 결과에 대한 정량적 정보를 제공할 수 있습니다.

그림 8. 여기 12 electroporation 조건의 각 이하 5 세포가 게재되는 통로에 긍정적인 GFP 아르 세포의 비율입니다. 최대 transfection 비율이 가장 강한 정사각형 웨이브 펄스에서 높은 전압 지수 붕괴 펄스, 상태 6, 70 % 이하 약 80 %입니다 상태 12, 테스트.

그림 9. 세포 전에 electroporation 9 회 합격으로 transfection 비율의 전반적인 패턴이 거의 동일하지만, transfection 비율에서 아주 약간의 감소와 함께.

그림 10. 여기에 표시가 통로 젊은 세포에 비해 transfection 비율에 표시된 감소를 보여 13 세포에 GFP 세포의 비율입니다. 가장 높은 transfection 비율은 최대한 빨리 격리 후 건강한 세포를 사용하는의 중요성을 보여주는 젊은 세포로 달성했던 약 절반되었습니다.

진 Pulser MXcell를 사용하여 transfecting MEF 세포에 사용 Electroporation 조건
조건 (1-6) 지수 붕괴 펄스, 350 UF, 1000ohm 모든	전압 (V)
1	200
2	250
3	300
4	326
5	350
6	376
조건 (7-12) 스퀘어 웨이브 펄스, 2,000 UF, 1000 옴, 1 펄스 모든	전압 (V)	펄스 기간 (MS)
7	200	10
8	250	10
9	300	10
10	200	20
11	250	20
12	300	20

Discussion

이 동영상이 문서에서는 쉽게 MEFs 또는 기타 기본 세포 라인에 대한 최적의 electroporation 조건을 식별하는 MXcell의 electroporation 시스템을 사용하는 방법을 보여줍니다. 많은 사람들이 많은 별도의 실험에 대한 필요성을 없앨 수 동시에 수행하는 실험이나 최적화 조건의 복제에 대한 96 - 웰 플레이트 형식 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안, 하나는 가능한 한 빨리 격리 후 건강한 세포를 사용하고 electroporation 버퍼에 일치 electroporation 조건을 사용하는 기억한다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gene Pulser® Electroporation Buffer	Bio-Rad	165-2676
Gene Pulser MXcell™ Electroporation System	Bio-Rad	165-2670
Gene Pulser MXcell™ ShockPod™ Cuvette Chamber	Bio-Rad	165-2673
Gene Pulser MXcell™ Electroporation System With ShockPod™ Cuvette Chamber	Bio-Rad	165-2674