Summary
En metod för att isolera specifika celltyper från växtmaterial visas. Denna teknik använder transgena markör som uttrycker fluorescerande proteiner i synnerhet celltyper, cellulär dissociation och fluorescens aktiverad cell sortering. Dessutom är en tillväxt inställning etablerade här som underlättar behandlingen av
Abstract
Högupplöst, ökar celltyp-specifik analys av genuttryck stor förståelse för utvecklings-reglering och svar på stimuli från omgivningen i alla flercelliga organismer. In situ hybridisering och reporter gen visualisering kan i begränsad omfattning användas för detta ändamål, men för hög upplösning kvantitativa RT-PCR eller hög genomströmning transkriptom analys av hela isolering av RNA från vissa celltyper är nödvändiga. Cellulär dissociation av vävnad som uttrycker ett fluorescerande protein markör i en specifik celltyp och efterföljande Fluorescens Aktivt cellsortering (FACS) gör det möjligt att samla tillräckligt med material för RNA-extraktion, cDNA syntes / amplifiering och microarray analys.
En omfattande uppsättning av celltyp specifika fluorescerande reporter linjer är tillgängliga för anläggningen forskarsamhället. I detta fall är två markör linjer i Arabidopsis thaliana roten som används: P SCR:: GFP (endodermis och vilande mitten) och P WOX5:: GFP (vilande mitten). Ett stort antal (tusentals) plantor odlas hydroponically eller på agarplattor och skördas för att få tillräckligt rot-material för vidare analys. Cellulär dissociation av växtmaterial sker genom enzymatisk nedbrytning av cellväggen. Detta förfarande använder sig av hög osmolaritet-inducerad plasmolysis och kommersiellt tillgängliga cellulaser att pectinases och hemicellulases släppa protoplasts i lösning.
FACS av GFP-positiva celler använder sig av visualisering av det gröna mot de röda emissionsspektra av protoplasts upphetsad av en 488 nm laser. GFP-positiva protoplasts kan särskiljas genom deras ökade andelen grön till röd utsläpp. Protoplasts är vanligtvis sorteras direkt i RNA extraktionsbuffert och lagras för vidare bearbetning vid ett senare tillfälle.
Denna teknik är visar sig vara enkelt och praktiskt. Dessutom är det visat att den kan användas utan svårighet att isolera tillräckligt många celler för transkriptom analys, även för mycket knappa celltyper (t.ex. vilande centrum celler). Slutligen är en tillväxt setup för Arabidopsis plantor visat att möjliggör okomplicerad behandling av växter före cell sortering (t.ex. för cellen typspecifika analys av biotiska eller abiotisk stress svar). Potentiella kompletterande användningsområden för FACS av vegetabiliskt protoplasts diskuteras.
Protocol
1) Beredning av växtmaterial
- Protoplasts kan härledas från många olika växtarter och vävnader under förutsättning att den rätta kombinationen av cellvägg enzymer används 1. Innan ett fullskaligt experiment utförs, är en småskalig rötning av materialet lämpligt för att utvärdera protoplasting effektiviteten i vävnaden, enzymer, etc. och att uppskatta procent positiva celler för cell sortering. Här protoplasts härrör från rötterna från Arabidopsis thaliana plantor som celltyp-specifikt uttryck för grönt fluorescerande protein (GFP) används. Den endodermis och inaktiv centrum är markerade med P SCR:: GFP och rofylld centrum av P WOX5:: GFP 2,3 (figur 1).
- Plantor odlas hydroponically i phytatrays (Sigma, figur 2a) på en nylon filter (250 ìm mesh, NITEX) som låter rötterna växa genom i odlingsmedium (0,22% w / v Murashige och Skoog bassubstratets [Sigma], 1% w / v sackaros, 0,05% w / v MES [2 - (N-morpholino) ethanesulfonic syra], pH 5,7 med KOH). Alternativt kan växter som odlas på toppen av en nylon-filter (100 ìm mesh) i vertikalt 1% agarplattor (figur 2b).
- Användningen av de ovan nämnda filter inte bara stöd i skörden av rötterna, det underlättar också lätt ytterligare behandling av plantor, om så önskas. Filtren låta plantorna att överföra en masse till nya phytatrays eller plattor agar kompletteras med en katalysator av intresse. Till exempel upp phytatray som har använts för cell typspecifika analys av transkriptionell svar på kväverening i Arabidopsis plantor 4.
- Se till mikroskop att din fluorescerande markör korrekt uttryckt (speciellt vid användning av behandlingsalternativ, som den celltyp-specifika markörer själva kan påverkas av behandlingen). I detta fall är plantorna inspekteras under ett fluorescensmikroskop (Nikon, Figur 1). Observera att celltyp specifika fluorescerande markör förbindelser bör präglas initialt under ett konfokalmikroskop att avgöra exakt vilka typer av celler är markerade och bestämma variation i uttryck.
2) Beredning av protoplasting lösningen
- Lös upp 1,25% w / v cellulas (Yakult), 0,3% w / v Macerozyme (Yakult), 0,4 M D-mannitol 20 mM MES och 20 mm KCl (från en 1 M beståndet) i avjoniserat vatten och justera pH till 5,7 med 1 M Tris / HCl pH 7,5. Denna lösning kommer att bli något grumlig.
- Värm upp lösningen till 55 ° C i 10 minuter (lösningen blir klar) och låt den svalna till rumstemperatur innan du lägger till 0,1% w / v BSA (bovint serumalbumin), 10 mm CaCl 2, och 5 mm β-merkaptoetanol .
3) Skörd och protoplasting av växtmaterialet
- Rötterna skördas genom att skrapa bort dem från nylon mesh med en skalpell och deponeras i en kolv som innehåller protoplasting lösningen. Generellt sett är 10 ml protoplasting lösning som används per 1500 fröplanta rötter.
- Skaka kolvarna försiktigt (75 min) i rumstemperatur i en timme. En längre inkubationstiden kan öka protoplastfusion avkastningen men kommer också att lägga till effekten av protoplasting sig på genuttryck.
- Filtrera protoplastfusion lösning med en 40 ìm cell sil (BD Falcon) och dela den lösning över koniska 15 ml rör (BD Falcon).
- Snurra rören i en swing-hink centrifug i 10 minuter vid 500 g. Notera att detta centrifugeringsvarvtal beror på vilken typ av protoplasts, deras bräcklighet och mängden av cellfragment produceras under enzymatisk behandling.
- Ta bort större delen av supernatanten, återsuspendera protoplasts i de återstående lösningen och inspektera dem i mikroskop (Figur 3).
- Utnyttja en hemacytometer att uppskatta antalet och tätheten av protoplasts. Cellen densiteten avgör hastigheten prov injektion, händelser per sekund och därmed den sammanlagda tiden för att sortera celler vid FACS (se även avsnitt 4.3).
- 3,7) Antingen gå direkt till FACS eller tvätta och resuspendera protoplasts i en inkubation lösning, exempelvis W5 (154 mM NaCl, 125 mm CaCl2, 5 mm KCl, 5 mm MES, justera pH till 5,7 med KOH) eller protoplasting lösning utan läggas enzymer. Speciellt när man tittar på transkriptionell förändringar är det viktigt att minimera exponeringen av proverna till förhållanden som kan påverka genuttrycket, såsom att ändra buffra protoplasts hålls i. Det rekommenderas därför att hålla protoplasts i protoplasting lösning och gå vidare att FACS så snart som möjligt.
4) Fluorescens Aktiverat Cell Sortering av protoplasts
- Slå på och förbereda cellen sorterare. Här är en FACSAria (BD) använts.
- Sätt upp ett flöde ström med en 100 & mu, m munstycke och ett 20 psi slida tryck.
- Cellen densitet och injektion av provet hastighet kan anpassas till de särskilda experiment baserat på om ett bästa möjliga avkastning eller snabbast möjligt hastigheten önskas. Vi har sorterat framgångsrikt med tätheter på upp till 10 miljoner celler / ml.
- Använd alternativet prov agitation på FACS för att förhindra sedimentering av protoplasts. Om igensättning av FACS är en fråga, det finns tre möjliga felsökning steg: 1. Utför ett prov-line backspolning. 2. Späd din protoplastfusion fjädring för att minska densiteten. 3. Städa upp protoplastfusion lösningen genom att upprepa filtrering steg (3,3) efter centrifugering och resuspension.
- Förbered apparaten för att mäta Forward Scatter (FSC), sidospridning (SSC) och utsläpp på 530/30 nm för GFP och 610/20 nm för rött spektrum autofluorescens (RSA) efter excitation av en 488 nm laser. Dessa är i huvudsak de enda parametrar som används för att isolera GFP-positiva protoplasts. Här var spänningen inställningarna enligt följande: FSC - 60V, SSC 250V, GFP 350V och RSA 335V. Observera att den optimala spänningen inställningar kommer att vara olika för varje FACS och kommer även behöva justeras hela livstid cellen sorterare.
- Börja med att inrätta en dotplot för Forward Scatter kontra Side Scatter. Applicera den spänning inställningarna så att de uppmätta händelserna är centrerade i ytan.
- Nästa steg, skapa en prick tomt på grönt kontra röd fluorescens signaler. Applicera den spänning inställningarna så att den uppmätta händelser ger en centrerad diagonal befolkningen i tomt när man tittar på en vildtyp (icke-GFP) protoplastfusion suspension. En protoplastfusion avstängning från en GFP markör linjen ska producera en tydlig population av grönt fluorescerande händelser aldrig sett i vildtyp prover.
- Ställ ersättning begränsningar för att justera för spektral överlappning mellan GFP och RSA. Korrekt ersättning tvång inställningar kommer att möjliggöra en bättre separation av GFP-positiva protoplasts från den icke-GFP protoplasts och skräp. De begränsningar som används här är följande: RSA, minus 17,91% GFP.
- Sätt upp en grind för att identifiera GFP-positiva händelser, en negativ kontroll av icke-GFP protoplasts bör användas till stöd i att definiera porten gränser (Figur 4).
- Implementera en Forward Scatter cutoff för att lämna skräp ur analysen. Visualisera GFP-positiva händelser i FSC-mot SSC-plot för att avgöra placeringen av cutoff. Här var det cutoff satt till 5000. Observera att FACS räknas skräp som sortera händelser och ett prov med höga halter av partiklar kan ha olika procent GFP positiva händelser än väntat. Detta är inte nödvändigtvis ett problem. Men ju mer skräp i provet, desto längre slag kommer att ta.
- Beroende på experiment och överflödet av den celltyp som skall analyseras, ställ in FACS precision läge antingen för optimal avkastning eller optimal renhet av det sorterade celler.
- För RNA-extraktion, förbereda insamlingen rör (1,5 ml mikrofugrör rör) med lämplig mängd RNA extraktionsbuffert. Med denna inställning, kommer 20 tusen sortera händelser ger en total volym på ca 100 l som sorteras till 350 l extraktionsbuffert (RNeasy mikro kit, QIAGEN). Blanda proverna efter avslutad slag som cellsuspension kan poolen högst upp.
- Förvara prover eller gå direkt till RNA extraktion. Framgångsrika microarray analyser har förformade med RNA ur så lite som 500 sorterade händelser. Här använde vi en RNeasy mikro extraktion kit (QIAGEN), WT-Ovation Pico RNA Förstärkare och FL-Ovation cDNA Biotin modul V2 (NuGEN).
Representativa resultat
En phytatray cirka 1500 ett veckor gamla P SCR:: GFP plantor gav omkring 60.000 protoplasts (mätt med hemacytometer). 2,6% av 65.000 FACS bearbetade evenemang definieras som GFP-positiva och sorterades (figur 4b).
Åtta plattor på ca 1500 fyra dagar gamla P WOX5:: GFP plantor varje (12.000 totalt) gav ca 30.000.000 protoplasts (mätt med hemacytometer). 0,063% av 16.000.000 FACS bearbetade evenemang definieras som GFP-positiva och sorterades (Figur 4c).
10.000 sorteras händelser används vanligtvis för RNA-extraktion och kan ge 20 till 140 ng totala RNA (Figur 5).
Figur 1. Cell typspecifika GFP markör linjer i Arabidopsis rot. Fluorescensmikroskopi bilder är tagna med differential interferens kontrast (DIC) och en GFP filter på en Eclipse 90i mikroskop (Nikon) som körs på metamorfa programvara (Molecular Devices). DIC och GFP bilderna överlagras för visualisering ändamål. De två markör linjer som används i denna visuella experiment visas;a) P SCR:: GFP och b) P WOX5:: GFP.
Figur 2. Plantera odlingsbetingelser. Plantor odlades i en miljökontrollant hydroponically i phytatrays (en) eller vertikalt agarplattor (B).
Figur 3. Plantera protoplasts uttrycka GFP. Fluorescensmikroskopi bilder är tagna med differential interferens kontrast (DIC) och en GFP filter på en Eclipse 90i mikroskop (Nikon) som körs på metamorfa programvara (Molecular Devices). DIC och GFP bilderna överlagras för visualisering ändamål. Pilar indikerar en spricka cell, cell skräp och en GFP-positiva protoplastfusion. Avståndet mellan två vita linjer med 50 mm.
Figur 4. Fluorescens aktiverad cell sortering av GFP-positiva protoplasts Protoplasts från vild typ (a) P SCR:.: GFP (b) eller P WOX5:: GFP (c) markör linjer har analyserats och sorterats med en FACSAria (BD) med definierade grindar på en dotplot av grönt (530/30 nm, x-axeln) kontra rött (610/20 nm, y-axeln) fluorescens. 100 tusen händelser presenteras i varje tomt. De händelser som faller inom GFP sortering porten markeras grönt.
Figur 5. Representant RNA extraktion från 10,000 sorterade celler. Celler sorterades direkt till RNA extraktionsbuffert (QIAGEN) var RNA renas och kontrolleras för koncentration, renhet och integritet på ett 2100 Bioanalyzer (Agilent). Tre replikat för båda markör linjer visas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protoplasts kan i princip härledas från en mängd olika vegetabiliska vävnader, optimera gynnsamma förhållanden avsevärt kommer att förbättra RNA kvalitet och kvantitet. Både protoplasting lösningen och de valbara inkubation buffert som används kommer att påverka denna aspekt.
Många olika fluorescerande proteiner kan användas, beroende på kapacitet används FACS, t.ex. GFP, RFP, YFP, GFP eller deras många varianter och derivat. Uttrycket av markörerna kunde drivas inte bara av celltyp specifika initiativtagare eller förstärkare fällor, som visas här, men också genom din favorit promotor, t.ex. ett hormon lyhörd syntetisk reporter genen 5. Tvåfärgade FACS av vegetabiliskt protoplasts är också möjlig. Detta kan till exempel användas när du utför en övergående omvandling analys med hjälp av en vektor med ett fluorescerande positiv selektion markör 5.
Protoplasts kan också sorteras för analys av genomiska DNA, proteiner eller metaboliter 6. Hålla protoplasts vid liv efter sortering är utmanande på grund av deras känsliga natur, med en större (130 mikrometer) munstycke och lägre slida tryck och sortera in dem i en optimerad inkubation buffert kommer att öka efter sortera protoplastfusion livskraft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Science Foundation (bidrag nr. DBI 0.519.984) och National Institutes of Health (bidrag nr. 5R01GM078279) ..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-250/50 | |
| 100 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-100/47 | |
| Square petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-10k | |
| Phytatrays | Sigma-Aldrich | P1552 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium (MS) | Sigma-Aldrich | M5519 | |
| sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | 10 M stock |
| Eclipse 90i microscope | Nikon Instruments | ||
| Cellulase R-10 | Yakult Pharmaceutical | ||
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical | ||
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | M9546 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P8041 | 1 M stock |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| β-mercapt–thanol | Calbiochem | 444203 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C2536 | 1 M stock |
| orbital shaker | Labline Instruments | ||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| conical 15 ml tubes | BD Biosciences | 352196 | |
| table centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | Legend RT | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| FACSAria | BD Biosciences | ||
| 1.5 ml microfuge tubes | VWR international | 20170-38 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| WT-Ovation Pico RNA Amplification System | NuGEN | 3300_12 | |
| FL-Ovation cDNA Biotin Module V2 | NuGEN | 4200_12 |
References
- Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 127, 1466-1475 (2001).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127, 595-603 (2000).
- Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots. Nature. 433, 39-44 (2005).
- Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 803-808 (2008).
- Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. Positive fluorescent selection permits precise, rapid, and in-depth overexpression analysis in plant protoplasts. Plant Physiol. 149, 1231-1239 (2009).
- Petersson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis. Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).
