نحن تصف طريقة لمراقبة حقيقية تكرار وقت جزيئات الحمض النووي الفردية بوساطة بروتينات للنظام عاثية تكرارها.
Abstract
نحن تصف طريقة لمراقبة حقيقية تكرار وقت جزيئات الحمض النووي الفردية بوساطة بروتينات للنظام عاثية تكرارها. تم تعديل خطي λ الحمض النووي لديهم البيوتين على نهاية واحدة حبلا ، وشاردة digoxigenin على الطرف الآخر من نفس حبلا. ويرد في نهاية biotinylated إلى ساترة الزجاج functionalized ونهاية digoxigeninated إلى حبة صغيرة. تجميع هذه الحبال حبة الحمض النووي على سطح خلية تدفق يسمح ليتم تطبيقها على تدفق الصفحي لممارسة القوة اسحب على حبة. نتيجة لذلك ، ويمتد على مقربة من الحمض النووي وموازية لسطح ساترة في القوة التي يحددها معدل التدفق (الشكل 1). ويتم قياس طول الحمض النووي عن طريق رصد موقف حبة. وتستخدم طول الخلافات بين الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل ، ومضاعفة للحصول على معلومات في الوقت الحقيقي على النشاط المتماثل من البروتينات عند مفترق الطرق. قياس موقف يسمح حبة التحديد الدقيق لمعدلات وprocessivities من الحمض النووي الفك والبلمرة (الشكل 2).
Protocol
1. الحمض النووي المتماثل قالب الحمض النووي للتفاعل هي DNA λ خطي تعديلها من قبل من الصلب [أليغنوكليوتيد] لتشكيل الشوكة تكرارها. بالإضافة إلى ذلك ، تعلق البيوتين إلى نهاية واحدة حبلا من الحمض النووي λ ، وتعلق شاردة digoxigenin إلى الطرف الآخ…
Discussion
من المهم التأكد من أن قوة السحب التي تمارس على تدفق الصفحي الخرز التي لا تؤثر على الأنشطة الأنزيمية للبروتينات تكرارها. على سبيل المثال ، قوة PN 3 الذي يتوافق مع معدل تدفق 0.012 مل / دقيقة لا تؤثر على تكرار حبلا الحمض النووي الرائدة. ومع ذلك فإنه لا يؤثر على الأنشطة الأنزيم…
Acknowledgements
وقد ساعد تطور الحمض النووي التي تمتد مقايسة بلايني بول جونغ بونغ لي ، وسمير حمدان. ويؤيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح لتشارلز ريتشاردسون (GM54397) ، وأنطوان فان Oijen (GM077248).
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Bacteriophage λ DNA
New England Biolabs
N3011L
DNA Oligonucleotides
Integrated DNA Technologies
T4 DNA Ligase
New England Biolabs
M0202L
T4 Polynucleotide Kinase
New England Biolabs
M0201L
α-digoxigenin Fab
Roche
11214667001
Tosyl Activated Beads
Dynal/Invitrogen
142-03
Magnetic Separator
Invitrogen
Dynal MPC
3-aminopropyl-triethoxysilane
Sigma
A3648
Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces
Succinimidyl propionate PEG
Nektar
Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Biotin-PEG-NHS
Nektar
Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Double-sided tape
Grace BioLabs
SA-S-1L
100 μm thickness
Quartz slide
Technical Glass
20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)
Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net)
Polyethylene tubing
Becton Dickinson
427416
0.76 mm ID, 1.22 OD
Other size tubing can be substituted.
Streptavidin
Sigma
S4762
Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3
Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix
New England Biolabs
N0447
Inverted Optical Microscope with 10X Objective
Olympus
Olympus IX-51
Permament rare-earth magnet
National Imports
www.rare-earth-magnets.com
CCD Camera
QImaging
Rolera-XR Fast 139
Syringe Pump
Harvard Apparatus
11 Plus
Operate in refill mode to facilitate solution changes
Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay. J. Vis. Exp. (37), e1689, doi:10.3791/1689 (2010).