हम व्यक्तिगत डीएनए जीवाणुभोजी प्रतिकृति प्रणाली के प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता अणुओं की वास्तविक समय प्रतिकृति के अवलोकन के लिए एक विधि का वर्णन.
Abstract
हम व्यक्तिगत डीएनए जीवाणुभोजी प्रतिकृति प्रणाली के प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता अणुओं की वास्तविक समय प्रतिकृति के अवलोकन के लिए एक विधि का वर्णन. Linearized λ डीएनए के एक भूग्रस्त के अंत पर एक बायोटिन, और ही भूग्रस्त के दूसरे छोर पर एक digoxigenin आधा भाग है संशोधित किया गया है. biotinylated अंत functionalized कांच coverslip और एक छोटे से मनका के digoxigeninated अंत से जुड़ी है. एक प्रवाह सेल की सतह पर इन डीएनए मनका tethers के विधानसभा लामिना का प्रवाह के लिए मनका पर एक खींचें बल लागू लागू किया जा करने के लिए अनुमति देता है. एक परिणाम के रूप में, डीएनए करीब करने के लिए और एक शक्ति है कि प्रवाह की दर (चित्रा 1) द्वारा निर्धारित किया जाता है पर coverslip की सतह के समानांतर फैला है. डीएनए की लंबाई मनका की स्थिति की निगरानी के द्वारा मापा जाता है. एकल और डबल असहाय डीएनए के बीच अंतर करने के लिए लंबाई दोराहे पर प्रतिकृति प्रोटीन की गतिविधि पर वास्तविक समय जानकारी प्राप्त करने के लिए उपयोग कर रहे हैं. मनका की स्थिति को मापने और unwinding के डीएनए और polymerization (चित्रा 2) के दरों processivities के सटीक निर्धारण की अनुमति देता है.
Protocol
1. डीएनए प्रतिकृति टेम्पलेट प्रतिक्रिया के लिए डीएनए एक linearized λ oligonucleotides की annealing के लिए एक प्रतिकृति कांटा फार्म संशोधित डीएनए है. इसके अतिरिक्त, बायोटिन λ डीएनए के एक भूग्रस्त के अंत में संलग्न है, ?…
Discussion
यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि खींचें लामिना का प्रवाह द्वारा मनकों पर exerted बल प्रतिकृति प्रोटीन के enzymatic गतिविधियों को प्रभावित नहीं करता है है. उदाहरण के लिए, एक 3 PN शक्ति है कि 0.012 मिलीग्राम / मिनट की ए?…
Acknowledgements
परख खींच डीएनए के विकास पॉल Blainey, जोंग – बोंग ली, और समीर हमदान द्वारा सहायता प्राप्त किया गया था. यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान के चार्ल्स (GM54397) रिचर्डसन, और एंटोनी वैन Oijen (GM077248) संस्थान के द्वारा समर्थित है.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Bacteriophage λ DNA
New England Biolabs
N3011L
DNA Oligonucleotides
Integrated DNA Technologies
T4 DNA Ligase
New England Biolabs
M0202L
T4 Polynucleotide Kinase
New England Biolabs
M0201L
α-digoxigenin Fab
Roche
11214667001
Tosyl Activated Beads
Dynal/Invitrogen
142-03
Magnetic Separator
Invitrogen
Dynal MPC
3-aminopropyl-triethoxysilane
Sigma
A3648
Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces
Succinimidyl propionate PEG
Nektar
Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Biotin-PEG-NHS
Nektar
Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Double-sided tape
Grace BioLabs
SA-S-1L
100 μm thickness
Quartz slide
Technical Glass
20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)
Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net)
Polyethylene tubing
Becton Dickinson
427416
0.76 mm ID, 1.22 OD
Other size tubing can be substituted.
Streptavidin
Sigma
S4762
Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3
Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix
New England Biolabs
N0447
Inverted Optical Microscope with 10X Objective
Olympus
Olympus IX-51
Permament rare-earth magnet
National Imports
www.rare-earth-magnets.com
CCD Camera
QImaging
Rolera-XR Fast 139
Syringe Pump
Harvard Apparatus
11 Plus
Operate in refill mode to facilitate solution changes
Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay. J. Vis. Exp. (37), e1689, doi:10.3791/1689 (2010).