Мы опишем метод для наблюдения реального времени репликации отдельных молекул ДНК посредничестве белков системы репликации бактериофагов.
Abstract
Мы опишем метод для наблюдения реального времени репликации отдельных молекул ДНК посредничестве белков системы репликации бактериофагов. Линеаризованные λ ДНК модифицируется, чтобы биотина на конце одной цепи, и дигоксигенин фрагмент на другом конце той же цепи. Биотинилированного конец крепится к функционализированных покровного стекла и digoxigeninated конец небольшой шарик. Сборка этих ДНК-бусинка тросов на поверхности проточной ячейке позволяет ламинарного течения, которые должны применяться приложить силы сопротивления на шарик. В результате ДНК растягивается вблизи и параллельно поверхности покровного на силу, которая определяется по скорости потока (рис. 1). Длина ДНК измеряется мониторинга положение валика. Длина различия между одно-и двухцепочечной ДНК используются для получения информации в реальном времени от активности белков репликации на вилку. Измерение положения шарик позволяет точно определить ставки и processivities ДНК размотки и полимеризации (рис. 2).
Protocol
1. Шаблон репликации ДНК ДНК для реакции линеаризованной ДНК λ изменены отжига олигонуклеотиды для формирования репликации вилкой. Кроме того, биотин прикрепляется к концу одной нити ДНК λ, и дигоксигенин фрагмент присоединен к другому концу той же цепи 1. <p class="jove…
Discussion
Важно, чтобы гарантировать, что сила сопротивления, действующая на бисер по ламинарного потока не влияет на ферментативную деятельность репликации белков. Например, 3 пН сила, которая соответствует скорости потока 0,012 мл / мин не влияет на репликацию ДНК, ведущей нити. Она тем не менее вл…
Acknowledgements
Развитие ДНК растяжение анализа была сообщница, Пол Blainey, Чен Ли Бон, и Самир Хамдан. Эта работа проводится при поддержке Национального института здоровья гранты Чарльз Ричардсон (GM54397), и Антуан ван Oijen (GM077248).
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Bacteriophage λ DNA
New England Biolabs
N3011L
DNA Oligonucleotides
Integrated DNA Technologies
T4 DNA Ligase
New England Biolabs
M0202L
T4 Polynucleotide Kinase
New England Biolabs
M0201L
α-digoxigenin Fab
Roche
11214667001
Tosyl Activated Beads
Dynal/Invitrogen
142-03
Magnetic Separator
Invitrogen
Dynal MPC
3-aminopropyl-triethoxysilane
Sigma
A3648
Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces
Succinimidyl propionate PEG
Nektar
Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Biotin-PEG-NHS
Nektar
Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Double-sided tape
Grace BioLabs
SA-S-1L
100 μm thickness
Quartz slide
Technical Glass
20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)
Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net)
Polyethylene tubing
Becton Dickinson
427416
0.76 mm ID, 1.22 OD
Other size tubing can be substituted.
Streptavidin
Sigma
S4762
Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3
Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix
New England Biolabs
N0447
Inverted Optical Microscope with 10X Objective
Olympus
Olympus IX-51
Permament rare-earth magnet
National Imports
www.rare-earth-magnets.com
CCD Camera
QImaging
Rolera-XR Fast 139
Syringe Pump
Harvard Apparatus
11 Plus
Operate in refill mode to facilitate solution changes
Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay. J. Vis. Exp. (37), e1689, doi:10.3791/1689 (2010).