Nós descrevemos um método para observar a replicação em tempo real de moléculas de DNA individual mediada por proteínas do sistema de replicação bacteriófago.
Abstract
Nós descrevemos um método para observar a replicação em tempo real de moléculas de DNA individual mediada por proteínas do sistema de replicação bacteriófago. Linearizada λ DNA é modificada para ter um biotina na extremidade de um fio, e uma porção digoxigenina na outra extremidade do fio mesmo. O fim biotinilado é anexado a uma lamela de vidro funcionalizadas eo fim digoxigeninated para uma pequena pérola. A montagem destas amarras DNA-pérola sobre a superfície de uma célula de fluxo permite um fluxo laminar para ser aplicado a exercer uma força de arrasto na esfera. Como resultado, o DNA é esticada próximo e paralelo à superfície da lamínula, a uma força que é determinado pela taxa de fluxo (Figura 1). O comprimento do DNA é medida através do monitoramento da posição do talão. Diferenças de comprimento entre o DNA de um único e double-stranded são utilizados para obter informações em tempo real sobre a atividade das proteínas de replicação na bifurcação. Medir a posição do talão permite a determinação precisa das taxas e processivities de DNA descontrair e polimerização (Figura 2).
Protocol
1. Modelo de replicação do DNA DNA para a reação é um DNA λ linearizada modificado por anelamento de oligonucleotídeos para formar uma forquilha de replicação. Além disso, biotina é anexado ao final de uma vertente do DNA λ, e uma porção digoxigenina está ligado à outra extremidade do fio mesmo 1. Materiais: Bacteriófago λ DNA, Oligonucleotídeos: braço garfo biotinilado (A: 5'-biotina-AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGA…
Discussion
É importante assegurar que a força de arrasto exercida sobre contas pelo fluxo laminar não influencia atividades enzimáticas das proteínas de replicação. Por exemplo, uma força de 3 pN que corresponde a uma vazão de 0,012 ml / min não afetam a replicação do filamento de DNA de liderança. Isto, contudo, afetar as atividades enzimáticas que ocorrem durante a síntese de DNA coordenada, e, portanto, tem que ser reduzida para 1,5 pN. A força de arrasto pode ser facilmente controlado, alterando a taxa de fluxo…
Acknowledgements
O desenvolvimento do DNA que se estende do ensaio foi auxiliado por Paulo Blainey, Lee Jong-Bong, e Hamdan Samir. Este trabalho é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede a Charles Richardson (GM54397), e Antoine van Oijen (GM077248).
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Bacteriophage λ DNA
New England Biolabs
N3011L
DNA Oligonucleotides
Integrated DNA Technologies
T4 DNA Ligase
New England Biolabs
M0202L
T4 Polynucleotide Kinase
New England Biolabs
M0201L
α-digoxigenin Fab
Roche
11214667001
Tosyl Activated Beads
Dynal/Invitrogen
142-03
Magnetic Separator
Invitrogen
Dynal MPC
3-aminopropyl-triethoxysilane
Sigma
A3648
Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces
Succinimidyl propionate PEG
Nektar
Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Biotin-PEG-NHS
Nektar
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Double-sided tape
Grace BioLabs
SA-S-1L
100 μm thickness
Quartz slide
Technical Glass
20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)
Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net)
Polyethylene tubing
Becton Dickinson
427416
0.76 mm ID, 1.22 OD
Other size tubing can be substituted.
Streptavidin
Sigma
S4762
Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3
Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix
New England Biolabs
N0447
Inverted Optical Microscope with 10X Objective
Olympus
Olympus IX-51
Permament rare-earth magnet
National Imports
www.rare-earth-magnets.com
CCD Camera
QImaging
Rolera-XR Fast 139
Syringe Pump
Harvard Apparatus
11 Plus
Operate in refill mode to facilitate solution changes
Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay. J. Vis. Exp. (37), e1689, doi:10.3791/1689 (2010).