우리는 박테리오 파지 복제 시스템의 단백질에 의해 매개 개인의 DNA 분자의 실시간 복제를 관찰하는 방법을 설명합니다.
Abstract
우리는 박테리오 파지 복제 시스템의 단백질에 의해 매개 개인의 DNA 분자의 실시간 복제를 관찰하는 방법을 설명합니다. 선형 λ DNA는 한 가닥의 끝 부분에 비오틴과 같은 스트랜드의 다른 끝에 digoxigenin의 잔기을 가지고 수정됩니다. biotinylated 결국은 기능화 유리 coverslip과 작은 구슬로 digoxigeninated 끝에 첨부되어 있습니다. 흐름 세포의 표면에 이러한 DNA – 비즈 tethers의 조립이 층류가 구슬에 드래그 힘을 발휘에 적용할 수 있습니다. 결과적으로 DNA가와 병렬 유량 (그림 1)에 의해 결정됩니다 강제에 coverslip의 표면 가까이에 뻗어있다. DNA의 길이는 비드의 위치를 모니터링하여 측정됩니다. 단일 및 이중 좌초된 DNA 사이의 길이 차이는 분기점에서 복제 단백질의 활동에 대한 실시간 정보를 얻을 활용하고 있습니다. 비드의 위치를 측정하는 것은 긴장을 풀기 DNA와 중합 (그림 2)의 속도와 processivities의 정확한 결정을하실 수 있습니다.
Protocol
1. DNA 복제 템플릿 반응에 대한 DNA가 복제 포크를 형성 oligonucleotides의 어닐링에 의해 수정된 선형 λ의 DNA입니다. 또한, 비오틴은 λ의 DNA 중 한 가닥의 끝 부분에 첨부하고, digoxigenin의 잔기가 같은 스트랜드 1 상대방에 첨부되어 있습니다. 자료 : 박테리오 파지 λ의 DNA, Oligonucleotides : biotinylated 포크 팔 (A : 5' – 비오틴 – AAAAAAAAAAAAAAAAGAG…
Discussion
층류 흐름에 의해 구슬을 끼쳤다 드래그 팀은 복제 단백질의 효소 활동에 영향을 미치지 않도록하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 0.012 ML / 분 유량에 해당하는 3 PN 인력은 DNA 선도 가닥의 복제에는 영향을 미치지 않습니다. 그것은 그러나 조정의 DNA 합성 동안을 효소 활동에 영향을 미치지 않으며, 그것은 따라서 1.5 PN을 줄일 수있다. 드래그 힘을 쉽게 유속 또는 유량 채널 5 너비를 변경하…
Acknowledgements
분석에 이르는 DNA의 발전은 폴 Blainey, 종 봉과 사미르 Hamdan하여 주었되었습니다. 이 작품은 찰스 리차드슨 (GM54397), 그리고 안토니 반 Oijen (GM077248)로 건강을 부여의 국립 연구소에 의해 지원됩니다.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Bacteriophage λ DNA
New England Biolabs
N3011L
DNA Oligonucleotides
Integrated DNA Technologies
T4 DNA Ligase
New England Biolabs
M0202L
T4 Polynucleotide Kinase
New England Biolabs
M0201L
α-digoxigenin Fab
Roche
11214667001
Tosyl Activated Beads
Dynal/Invitrogen
142-03
Magnetic Separator
Invitrogen
Dynal MPC
3-aminopropyl-triethoxysilane
Sigma
A3648
Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces
Succinimidyl propionate PEG
Nektar
Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Biotin-PEG-NHS
Nektar
Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Double-sided tape
Grace BioLabs
SA-S-1L
100 μm thickness
Quartz slide
Technical Glass
20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)
Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net)
Polyethylene tubing
Becton Dickinson
427416
0.76 mm ID, 1.22 OD
Other size tubing can be substituted.
Streptavidin
Sigma
S4762
Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3
Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix
New England Biolabs
N0447
Inverted Optical Microscope with 10X Objective
Olympus
Olympus IX-51
Permament rare-earth magnet
National Imports
www.rare-earth-magnets.com
CCD Camera
QImaging
Rolera-XR Fast 139
Syringe Pump
Harvard Apparatus
11 Plus
Operate in refill mode to facilitate solution changes
Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay. J. Vis. Exp. (37), e1689, doi:10.3791/1689 (2010).