Vi beskriver en metod för att observation realtid replikering av enskilda DNA-molekyler förmedlas av proteiner från bakteriofag replikering systemet.
Abstract
Vi beskriver en metod för att observation realtid replikering av enskilda DNA-molekyler förmedlas av proteiner från bakteriofag replikering systemet. Linjäriserade λ DNA är modifierad så den har en biotin på slutet av en tråd, och en digoxigenin fraktionen i andra änden av samma tråd. Den biotinylerad änden är ansluten till en functionalized glas täckglas och digoxigeninated slut på en liten pärla. Monteringen av dessa DNA-sträng tjuder på ytan av ett flöde cell gör ett laminärt flöde som skall tillämpas för att utöva en dragkraft på pärlan. Som ett resultat, är DNA sträcks nära och parallellt med ytan på täckglas vid en kraft som bestäms av flödet (Figur 1). Längden på DNA mäts genom att övervaka läget för pärla. Längd skillnader mellan enkel-och dubbelsträngat DNA används för att få information i realtid om verksamheten för replikering proteiner på gaffeln. Mätning av läge pärla ger en exakt bestämning av priser och processivities av DNA varva ner och polymerisation (figur 2).
Protocol
1. DNA-replikering Mall DNA för reaktionen är en linjär λ DNA modifieras av glödgning av oligonukleotider att bilda en replikering gaffel. Dessutom är biotin bifogas i slutet av en del av λ DNA, och en digoxigenin fraktion är ansluten till den andra änden av samma område 1. Material: bakteriofag λ DNA, oligonukleotider: biotinylerad gaffel armen (A: 5'-biotin-AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGCATCAATCACAGGGTCAGGTTCGTTATTGT…
Discussion
Det är viktigt att se till att dra kraft som verkar på pärlor med laminärt flöde inte påverkar enzymaktiviteten av replikering proteiner. Till exempel påverkar ett 3 pn-kraft som motsvarar ett flöde på 0,012 ml / min inte replikering av DNA ledande strängen. Det påverkar dock enzymatisk aktiviteter som äger rum under samordnad DNA-syntes, och det måste därför reduceras till 1,5 PN. Den dragkraft kan enkelt kontrolleras genom att ändra flödet eller en bredd av flödet kanal 5.
<p class="jo…
Acknowledgements
Utvecklingen av DNA-stretching analysen fick hjälp av Paul Blainey, Jong-Bong Lee, och Samir Hamdan. Detta arbete stöds av National Institutes of Health bidrag till Karl Richardson (GM54397), och Antoine van Oijen (GM077248).
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Bacteriophage λ DNA
New England Biolabs
N3011L
DNA Oligonucleotides
Integrated DNA Technologies
T4 DNA Ligase
New England Biolabs
M0202L
T4 Polynucleotide Kinase
New England Biolabs
M0201L
α-digoxigenin Fab
Roche
11214667001
Tosyl Activated Beads
Dynal/Invitrogen
142-03
Magnetic Separator
Invitrogen
Dynal MPC
3-aminopropyl-triethoxysilane
Sigma
A3648
Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces
Succinimidyl propionate PEG
Nektar
Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Biotin-PEG-NHS
Nektar
Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Double-sided tape
Grace BioLabs
SA-S-1L
100 μm thickness
Quartz slide
Technical Glass
20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)
Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net)
Polyethylene tubing
Becton Dickinson
427416
0.76 mm ID, 1.22 OD
Other size tubing can be substituted.
Streptavidin
Sigma
S4762
Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3
Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix
New England Biolabs
N0447
Inverted Optical Microscope with 10X Objective
Olympus
Olympus IX-51
Permament rare-earth magnet
National Imports
www.rare-earth-magnets.com
CCD Camera
QImaging
Rolera-XR Fast 139
Syringe Pump
Harvard Apparatus
11 Plus
Operate in refill mode to facilitate solution changes
Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay. J. Vis. Exp. (37), e1689, doi:10.3791/1689 (2010).