Neutrofila Extracellulär Fällor (NET) är en viktig medfödda immunförsvaret mekanism för att bekämpa sjukdomsframkallande bakterier, svampar och parasiter. Här beskriver vi metoder för att isolera neutrofila granulocyter från humanblod och att aktivera dem att bilda NET. Vi presenterar beredningen tekniker för att visualisera NET inom ljus-och elektronmikroskopi.
Neutrofila granulocyter är den vanligaste gruppen av leukocyter i perifert blod. Som professionella fagocyter, de uppsluka bakterier och döda dem intracellulärt när deras antimikrobiella granulat säkring med phagosome. Vi fann att neutrofiler har ytterligare ett sätt att döda mikroorganismer: Vid aktivering, de släpper granulat proteiner och kromatin som tillsammans bildar extracellulära fibrer som binder patogener. Dessa nya strukturer, eller neutrofila Extracellulär fällor (NET), försämra virulensfaktorer och döda bakterier 1, svampar 2 och parasiter 3. Den strukturella ryggrad av nät är DNA, och de är snabbt bryts ned i närvaro av DNases. Således bakterier uttrycka DNases är mer virulent 4. Använda korrelat mikroskopi kombinera TEM, SEM, immunofluorescens och levande cell imaging tekniker, kunde vi visa att vid stimulering, kärnan av neutrofiler förlorar sin form och EU-och heterochromatin homogenisera. Senare kärnhöljet och membran granulat upplösas låta blandningen av NET-komponenter. Slutligen är det nät utsläppt som bryter cellmembranet. Denna celldöd programmet (NETosis) skiljer sig från apoptos och nekros och beror på generering av reaktiva syreradikaler av NADPH-oxidas 5.
Neutrofila extracellulära fällor är riklig i områden av akut inflammation. NET verkar vara en form av medfödda immunförsvaret som binder mikroorganismer, förhindra dem från att sprida sig, och garantera en hög lokal koncentration av antimikrobiella medel att förnedra virulensfaktorer och döda patogener vilket gör att neutrofiler att fullgöra sina antimikrobiella fungera även utanför deras livslängd. Det finns ökande bevis, dock att NET också involverade i sjukdomar som sträcker sig från autoimmuna syndrom till infertilitet 6.
Vi beskriver metoder för att isolera neutrofila granulocyter från perifert blod 7 och stimulera dem att bilda NET. Också vi inkluderar protokoll för att visualisera NET inom ljus-och elektronmikroskopi.
Den medföljande protokollet blir det möjligt isolering av icke stimuleras neutrofiler vid stor renhet, induktion av NET bildning och analys av morfologiska förändringar under NETosis. Vid hantering av prover med omsorg, det vill säga att undvika hårda tvätt förhållanden som kommer att resultera i förlust av de flesta av de löst bifogade NET, kan mängden NET bildas under olika stimulering villkor (varaktighet, stimulus) jämföras. I detta avseende kan den medföljande protokoll fungera som en utgångspunkt för att fastställa metoder för att analysera mer avancerade scenarion: neutrofila / patogen interaktioner, sekvens av stimuli, samspel med andra immunceller.