Neutrofili Trappole extracellulare (NET) sono un importante meccanismo immunitario innato per combattere i batteri patogeni, funghi e parassiti. Qui si descrivono i metodi per isolare i granulociti neutrofili dal sangue umano e di attivare per formare NET. Vi presentiamo le tecniche di preparazione di visualizzare reti in microscopia ottica ed elettronica.
Granulociti neutrofili sono il gruppo più abbondante di leucociti nel sangue periferico. Come fagociti professionali, fagocitare i batteri e li uccidono intracellulare quando la loro miccia antimicrobica granuli con la phagosome. Abbiamo scoperto che i neutrofili sono un ulteriore modo di uccidere i microorganismi: al momento dell'attivazione, rilasciano le proteine dei granuli e cromatina che insieme formano le fibre extracellulari che legano gli agenti patogeni. Queste nuove strutture, o neutrofili Trappole extracellulare (NET), degradano fattori di virulenza e di uccidere i batteri 1, 2 e funghi parassiti 3. La spina dorsale strutturale del NET è il DNA, e sono rapidamente degradati in presenza di DNasi. Così, i batteri che esprimono DNasi sono più virulenti 4. Utilizzando la microscopia correlativa combinando TEM, SEM, immunofluorescenza e vivere tecniche di imaging cellulare, abbiamo potuto dimostrare che dopo la stimolazione, i nuclei di neutrofili perdono la loro forma e la eu-eterocromatina e omogeneizzare. Più tardi, l'involucro nucleare e le membrane dei granuli disintegrano permettendo la miscelazione dei componenti NET. Infine, le reti sono rilasciati come rompe la membrana cellulare. Questo programma di morte cellulare (NETosis) è distinto da apoptosi e necrosi e dipende dalla generazione di specie reattive dell'ossigeno da NADPH ossidasi 5.
Neutrofili trappole extracellulare sono abbondanti nei siti di infiammazione acuta. NET sembrano essere una forma di risposta immunitaria innata che i microrganismi si legano, impediscono loro di diffondere e garantire una elevata concentrazione locale di agenti antimicrobici per degradare fattori di virulenza e uccidere gli agenti patogeni permettendo neutrofili per assolvere la loro funzione antimicrobica anche oltre la durata della loro vita. C'è una crescente evidenza, tuttavia, che le reti sono anche coinvolti in malattie che vanno da auto-immune sindromi alla sterilità 6.
Si descrivono i metodi per isolare i granulociti neutrofili dal sangue umano periferico 7 e stimolarli a formare NET. Inoltre abbiamo incluso i protocolli per visualizzare le reti in microscopia ottica ed elettronica.
Il protocollo deve essere tale che l'isolamento di non neutrofili stimolati a notevole purezza, l'induzione della formazione del NET e l'analisi dei cambiamenti morfologici durante NETosis. Quando si maneggiano i campioni con cura, evitando cioè dure condizioni di lavaggio che comporta la perdita di gran parte delle reti debolmente attaccato, la quantità di formazione NET in condizioni di stimolazione differenti (durata, stimolo) possono essere confrontati. A questo proposito, i protocolli previsti può servire come punto di partenza per stabilire i metodi per analizzare gli scenari più sofisticati: le interazioni neutrofili / patogeno, sequenza di stimoli, interazione con altre cellule immunitarie.