Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Нейтрофилов внеклеточной Ловушки: Как создать и визуализировать их

doi: 10.3791/1724 Published: February 24, 2010

Summary

Нейтрофилов внеклеточной ловушки (сети) являются важным механизмом врожденного иммунитета для борьбы патогенных бактерий, грибков и паразитов. Здесь мы опишем методы, чтобы изолировать нейтрофильных гранулоцитов из крови человека и активировать их, чтобы сформировать NET. Мы представляем подготовку методов для визуализации сетей в световой и электронной микроскопии.

Abstract

Нейтрофильные гранулоциты являются наиболее распространенными группа лейкоцитов в периферической крови. Как профессиональные фагоциты, они поглощают бактерии и убивают их внутриклеточно, когда их антимикробной предохранитель гранулы с фагосомы. Мы обнаружили, что нейтрофилы имеют дополнительный способ убить микроорганизмы: после активации, они выпускают гранулы белков и хроматина, которые вместе образуют внеклеточные волокна, которые связывают патогенов. Эти новые структуры или нейтрофилов внеклеточной Ловушки (НРТ), ухудшают факторов вирулентности и убивают бактерии, 1, 2 грибков и паразитов, 3. Структурные основы сетей является ДНК, и они быстро разлагается в присутствии DNases. Таким образом, бактерии выражения DNases, более опасны, 4. Использование корреляционного микроскопию TEM объединения, SEM, иммунофлюоресценции и жить методы ячейка изображения, мы могли бы показать, что при стимуляции ядер нейтрофилов теряют свою форму и ес-и гетерохроматин гомогенизации. Позже, ядерной оболочки и мембраны гранулы распадаются позволяет смешивание NET компонентов. Наконец, сетки выпущен как перерывы клеточной мембраны. Эта программа гибели клеток (NETosis) отличается от апоптоза и некроза и зависит от поколения активных форм кислорода NADPH оксидазы 5.

Нейтрофилов внеклеточной ловушки в изобилии на сайтах острого воспаления. НРТ-видимому, форма врожденного иммунного ответа, которые связывают микроорганизмы, предотвратить их распространение, а также обеспечить высокие локальные концентрации антимикробных препаратов деградировать факторов вирулентности и убивать патогенные что позволяет нейтрофилов выполнять свои функции антимикробных даже за пределами их жизни. Существует все больше доказательств, однако, что НРТ также участвуют в заболеваниях, которые варьируются от аутоиммунных синдромов к бесплодию 6.

Мы опишем методы, чтобы изолировать нейтрофильных гранулоцитов из периферической крови человека 7 и стимулировать их к созданию NET. Также включают в себя протоколы для визуализации сетей в световой и электронной микроскопии.

Protocol

1. ПМН изоляции от человеческой крови

Используйте около 24 мл крови человека с ЭДТА или гепарин (10 ЕД / мл) в качестве антикоагулянта.

  1. Добавить 6 мл Histopaque 1119 по 15 мл трубки Сокол и тщательно слоя от 5 до 7 мл цельной крови на вершине.
  2. Центрифуга в течение 20 минут при 800 мкг без торможения.
  3. Аспирацию и отбросить желтоватый и ясный верхний слой и нижний красновато передачи фазы, содержащей гранулоцитов на свежий труб Falcon.
  4. Вымойте клетки, заполняя Сокол труб с PBS и центрифуги в течение 10 минут при 300 х г.
  5. В то же время подготовить 100% Перколла решение путем смешивания 18 мл Перколла с 2 мл 10х PBS. С 1x PBS подготовить 4 мл растворов 85%, 80%, 75%, 70% и 65% Перколла.
  6. Подготовка 2 Сокол трубки с градиентом Перколла отводками 2 мл каждый процент друг на друга в порядке убывания.
  7. После центрифугирования супернатант удалить, объединить окатышей и ресуспендирования осажденных клеток в 4 мл PBS.
  8. Тщательно слой 2 мл ресуспендирования на каждое из градиентов.
  9. Центрифуга в течение 20 минут при 800 мкг без торможения.
  10. После центрифугирования удалить верхний слой, и большинство из 65%-слой с МНПК и собирать белый оставшиеся интерфаз до 85% слоя в новые трубы Falcon.
  11. Вымойте клетки, заполняя Сокол труб с PBS и центрифуги в течение 10 минут при 300 х г.
  12. Удалить супернатант и ресуспендируйте осажденных клеток (обычно> 95% PMN) в 2 мл PBS.
  13. Граф клеток с использованием гемоцитометра.

2. Активация PMNs

  1. Подготовка 24-клеточной культуре также пластины, поставив стерильные 13 мм круглый скольжения покровного стекла (# 1,5) в каждую лунку
  2. Семенной 2 х 10 5 клеток в 500 мкл RPMI (содержащих 2% сывороточный альбумин человека) на лунку и инкубировать в течение 1 ч в CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° C.
  3. Тем временем подготовить 600 нм PMA решение в RPMI и добавить к клеткам 100 мкл на лунку. Инкубируйте от 15 минут до 4 часов в CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° C.
  4. Fix клеток в 4% (на конец концентрации) параформальдегид растворяется в PBS.

PMA выступает в качестве положительного контроля и до сих пор самым мощным агентом, чтобы побудить NET образования. Кроме того, другие стимулы или совместное культивирование с патогенами могут быть использованы для NET индукции.

Соответствующих статусу NET образование может быть проверена, а время идет конечно, если дополнительные параллельные образцы подготовлены. Если, не проникающий ДНК красителя, как Sytox Зеленый (Invitrogen) добавляется к нефиксированным клеток, внеклеточной ДНК только будут обнаружены. С образованием новых НРТ-то нарушения в присутствии Sytox, для каждого момента времени один параллельный пример должен быть использован.

3. NET обнаружения immunolabeling

НРТ очень хрупкие, даже после фиксации и должны управляться с большой осторожностью, в противном случае большинство будет теряться во время подготовки.

  1. Осторожно снимите скользит стеклянной крышкой с прикрепленными клетки с 24-и культуру пластину, подняв ее вверх на границе с изогнутой иглой и схватить ее тонкой щипцами. Положите покрытие скольжения вниз головой на каплю PBS. Это можно сделать на листе парафильмом покрытия стоят пробирки. Вымойте так 3 раза в течение 5 мин.
  2. Инкубируйте крышка скользит в том же порядке в капле 0,5% Тритон Х-100 в течение 1 мин при комнатной температуре, чтобы permeabilize клеток. Промыть 3 раза в PBS в течение 1 мин.
  3. Подготовка влажной камере с парафильмом и мокрой ткани. Положите крышку скользит вверх тормашками на каплю блокирующим буфером (5% осла сыворотки) и инкубировать 30 минут при температуре 37 ° C.
  4. Развести первичных антител, например мс анти Хистон и РБ анти эластазы нейтрофилов, в блокирующем буфере.
  5. Передача крышка скользит по влажной камере непосредственно от блокирующего буфера на падение первичного антитела и инкубировать в течение 1 часа при температуре 37 ° C.
  6. Промыть 3 раза по 5 мин с PBS.
  7. Развести вторичными антителами, например, DK анти мс Су2 и ДК анти РБ Cy3, в блокирующем буфере.
  8. Передача крышка скользит в влажной камере на каплю вторичными антителами и инкубировать в течение 1 часа при температуре 37 ° C.
  9. Промыть 3 раза по 5 мин с PBS. В зависимости от вашего флуоресценции вариантов микроскопии, пятна ДНК в течение 5 мин или с Hoechst 33342 (1 мкг / мл), который понадобится УФ возбуждения или с Draq5 для дальнего красного возбуждения и мыть дважды расстояние. водой.
  10. Установить 20 мкл капли Mowiol на предметное стекло и смонтировать покрытие скользит с клетками с ног на голову. Клетки должны быть в пределах от скольжения крышкой и слайдов. Капля Mowiol образуют тонкий слой однородной толщины, когда покровным стеклом расположен на капли. Как правило, нет необходимости нажимать образца. Если вы хотите использовать не-погружения линз, образца готова к проверке.Для микроскопического анализа с погружением линзы, не говоря образца сохнуть в течение приблизительно 1 часа, пока Mowiol укрепил на границе образца.

4. Подготовка сети для сканирующей электронной микроскопии (SEM)

  1. Сообщение исправить клеток на стеклянные крышки скользит в 24-луночный планшет с 2,5% глутарового альдегида.
  2. Удалить стеклянная крышка скользит, содержащих клетки из 24-и культуру пластину и поставить вверх дном на каплю воды. Вымойте так 3 раза в течение 5 мин.
  3. Передача крышка скользит обратно в 24-луночных культуре клеток пластину, содержащую 0,5% OsO4 и инкубировать 30 мин.
  4. Удалить стеклянная крышка скользит, содержащих клетки из 24-и культуру пластину и поставить вверх дном на каплю воды. Вымойте так 3 раза в течение 5 мин.
  5. Передача крышка скользит обратно в 24-клеточной культуре также пластины, содержащей 1% дубильной кислоты и инкубировать 30 мин.
  6. Повторите шаги с 4,2 до 4,4
  7. Дегидрировать через такую ​​схему (5 минут каждая):
    • 30% этанола
    • 50% этанола
    • 70% этанола
    • 80% этанола
    • 90% этанола
    • 100% этаноле
    • 100% этаноле
    • 100% этаноле
  8. Передача крышка скользит в критической точке сушилку и сухой образцы.
  9. Пальто поверхности образца с 5 нм платина / углерод слой с помощью тонкого слоя испарителя

5. Представитель Результаты:

Изоляции метод обычно дает нестимулированных жизнеспособных нейтрофилов с чистотой более 95%. При включенной в различные моменты времени после стимуляции иммунной протокол показана последовательность морфологических изменений при NETosis ячейки уплощение, утрата ядерной дольки, потеря гранул и ядро ​​целостность, что приводит к увеличению перекрытия ядерных (т.е. гистонов) и гранулированной (т.е. эластазы нейтрофилов) окрашивания. Этот протокол может служить отправной точкой для анализа специфических взаимодействий патогенов с нейтрофилов. Это взаимодействие можно разрезать более подробно использованием подготовка протокола для сканирующей электронной микроскопии.

NET флуоресценции

Пример вынужденного нейтрофилов окрашивают в течение NET компонентов (синий = ДНК, красный = гистонов, зеленый = эластазы нейтрофилов). Изображения показывают, помимо NET локализации, ядерной локализации ДНК и гистонов и гранулированных шаблон для эластазы нейтрофилов.

SEM PMA стимуляции

Сканирующего электронного микроскопа показывает, не стимулируется и PMA-стимулированных нейтрофилов. После стимуляции нейтрофилов выравниваться и производить NET.

SEM Сети и шигеллы

Более высокое разрешение изображения SEM бактерий Shigella в ловушке NET.

Discussion

При условии, протокол позволит изоляции, не стимулировали нейтрофилов на значительном чистоты, индукция NET формирования и анализа морфологических изменений при NETosis. При работе с образцами с осторожностью, т.е. избежать суровых условий промывки, что приведет к потере большей части свободно прилагается сетей, количество NET образование в различных условиях стимуляции (длительность стимула), можно сравнить. В этой связи, при условии, протоколы могут служить отправной точкой для разработки методов для анализа более сложных сценариев: нейтрофилов / патогена взаимодействия, последовательность стимулов, взаимодействие с другими иммунными клетками.

References

  1. Brinkmann, V. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 Forthcoming.
  2. Urban, C. F., Reichard, U., Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms. Cell Microbiol. 8, 668-676 (2006).
  3. M, E. Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps. PNAS. 106, 6748-6753 (2009).
  4. Buchanan, J. T., Simpson, A. J., Aziz, R. K., Liu, G. Y., Kristian, S. A., Kotb, M., Feramisco, J., Nizet, V. DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps. Curr Biol. 14, 396-400 (2006).
  5. Fuchs, T. A. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
  6. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nat Rev Microbiol. 5, 577-582 (2007).
  7. Aga, E., Katschinski, D. M., van Zandbergen, G., Laufs, H., Hansen, B., Muller, K., Solbach, W., Laskay, T. Inhibition of the spontaneous apoptosis of neutrophil granulocytes by the intracellular parasite Leishmania major. J Immunol. 169-898 (2002).
Нейтрофилов внеклеточной Ловушки: Как создать и визуализировать их
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them. J. Vis. Exp. (36), e1724, doi:10.3791/1724 (2010).More

Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them. J. Vis. Exp. (36), e1724, doi:10.3791/1724 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter