机器人技术和植物组织的基因表达研究的动态图像分析

Summary

我们报告的引进，跟踪和绿色荧光蛋白基因在植物细胞中表达的定量分析方法。这种方法是利用一个半连续图像采集大量样品的定制设计的机器人系统，随着时间的推移。我们也证明了ImageJ和ImageReady中使用图像序列的分析。

Abstract

通常在植物组织中的基因表达研究化合物从植物组织的破坏性开采

Protocol

以下方法概括为使用一个自动化的图像采集系统分析基因表达的形象的协议。为了便于说明，细分的总体思路是分为四个步骤：1）种子准备，2）基因导入用粒子轰击，3）机器人的图像采集，及4）图像分析。虽然这一般方法可用于范围广泛的其他应用程序使用，目前的协议集的基础上使用绿色荧光蛋白（GFP）的基因，这是一个有用的记者跟踪基因的表达基因在同一块随着时间的推移活组织。

一，种子的制备

1. 利马豆（ 菜豆lunatus CV恒基布什）的种子就可以买到，或生长的植物在生长室（相对湿度50％，16 / 8 h光照：黑暗，25/23 ° C昼/夜），理想收获。收获后的种子质量可保持在-20 ° C储存的种子
2. 准备发芽的种子品红GA7容器。折叠滤纸或纸巾，以适应在洋红色箱底部。每个容器添加〜25毫升去离子水，滋润纸巾，并倒出未吸收的水。高压灭菌20分钟浸湿的纸的盒子。
3. 用50毫升的一次性离心管中，10％的商业漂白剂溶液在回旋筛晃动在60转20分钟（20种子在20-40毫升）的种子消毒。
   注：所有的后续步骤，应在层流罩。
4. 每个冲洗过程中，轻轻摇动30秒，用无菌去离子水冲洗种子4-7次。
5. 将5-6位于每个无菌品红箱折叠纸层之间的无菌种子。
6. 在下列条件下孵育4天种子：25℃，16 / 8 h光照：黑暗和^{40μEm-2 s} - 1时。

二。基因导入使用粒子轰击

1. 建立使用您最喜爱的表达载体可以在活体组织监测与报告基因的基因结构。我们已经设计了一个高拷贝数表达载体启动子和启动子元素分析的有用。这个载体含有绿色荧光蛋白基因，这是用来显示子/启动子元素转化的组织功能。
2. 大约1-2 h前的轰炸，消费利马豆萌发幼苗子叶和去除种皮。适合轰击对子叶应为黄色，浅绿色，平整和无任何损害，可能会干扰进一步的图像分析。
3. 广场上的OMS文化媒介包含的MS盐^1，B5维生素^2，3％蔗糖和0.2％Gelrite（pH值5.7）被切除后立即子叶。
4. 沉淀的DNA构造上M10钨粒子（西尔韦尼亚，托旺达，PA，USA）。在0.6 ml离心管中，加25μL钨颗粒（颗粒悬浮于权使用前，无菌水，100毫克^毫升 -1），5μLDNA（1微克^{μL-1），25μL2.5}米氯化钙（Sigma公司- Aldrich公司的猫。C3881 - 500G）和10μL100毫米亚精胺（西格玛猫S - 2626）。涡简要彻底混合所有的组件。
5. 冰浴5分钟的孵育DNA的制备。然后，删除和丢弃50μL上清液。
6. 由涡旋重悬DNA包覆颗粒，并立即删除2μL等份。重复此涡旋的步骤每一个等分是从管中删除的时间。在冰和包覆颗粒应保持在15分钟内使用。
7. 通过注射器过滤器的顶部，放置2μL包覆颗粒在滤网中。将包含在过滤器内的粒子枪室控股单位的包覆颗粒过滤装置。
8. 放置了利马豆子叶近轴侧挡板，并将其放置在粒子枪室挡板。挡板，融化到一个烧杯的底部屏幕组成，是用来作为一个平台，以支持组织在轰击。
9. 炮击使用粒子枪（在这种方法中，我们使用一个简单而廉价的粒子流入^枪 3，猪，在我们的实验室设计）的组织如下：a）打开阀门导致的真空疏散室， b）在真空度达到（30）760毫米汞柱，启动电磁阀和释放氦气推动粒子，C）粒子轰击后，关闭真空阀门和使用排气阀释放真空。用来加速粒子的氦气压力是50psi。
10. 释放真空后，打开箱门，检索轰炸的子叶和子叶，近轴侧返回，OMS培养基。
    
    注意：对于定量分析和表达分析，我们通常轰炸至少三个每个DNA构造子叶。阳性对照，这是通常的DNA构造，给出了一个研究基因的表达谱，作为参考。

三。自动图像采集

1. 打开汞灯，等待灯30分钟的热身。
2. 打开电源现货RT CCD相机（诊断仪器公司，斯特林高地，心肌梗死，美国）和机器人技术平台电机控制器，驱动机器人平台的运动。
3. 设置过滤器上设置一个MZFLIII解剖显微镜检测绿色荧光蛋白（GFP2过滤器设置;前四十分之四百八纳米，EM 510唱片。）（莱卡，Heerbrugg，瑞士）。
4. 用70％乙醇喷洒消毒增厚聚碳酸酯培养皿盖子。专门盖，用来盖培养皿基地防止凝结在图像采集^4。
5. 载有关于机器人平台的自动图像采集系统（Arrick机器人），赫斯特，美国德克萨斯州的轰炸子叶板放置。设置由步进电机驱动的机器人平台和表包括8个培养皿中的附件。该平台是建聚碳酸酯，聚丙烯，铝。固定位置，固定螺丝拧紧外侧塑料板。
6. 打开自定义的应用软件，控制机器人平台和图像采集。此外，打开软件白光控制器开关。
7. 在“电机运动”标签，点击“电机”和“电机之家”。软件方向的起始位置的平台后，我们准备开始进入每子叶的位置。
8. 在“电机运动”标签，选择第一盘。该平台将显微镜的目标定位在培养皿的中心。使用移动距离按钮，精确定位图像采集的第一个子叶。随着白光控制器，可以观察到的目标区域，通过电脑显示器上的“直播模式”功能转向。
9. 对于第一个子叶，设置的重点和放大倍数（1.6倍的放大倍率是首选）使用解剖显微镜上的手动旋钮。在同一板块其余子叶的重点作出调整，三个找平每盘下方的螺丝，使用机器人平台上。
10. 一旦已设置感兴趣的区域，单击“添加这个位置”按钮。该软件将增加本地区的坐标位置的时间表文件，该平台将返回到该板块的中心。
11. 设置岗位和重点上的所有使用移动距离按钮和手动调平螺丝板剩余子叶。子叶的坐标已经输入后，保存的位置的时间表坐标。
12. 输入图像采集参数。在“图像设置”选项卡，选择所需的类型;白色或蓝色光。绿色荧光蛋白检测，只有蓝色的光芒，应使用。此外，进入曝光设置。虽然我们可以修改为红色，蓝色和绿色的色彩独立的曝光时间，我们通常使用相同的设置，使我们能够直接和GFP照片文档（20，14和红色，绿色和蓝色通道，分别为14秒）不同的DNA结构相一致的比较。
13. 在相同的“图像设置”选项卡，指定一个空的文件夹中的图像将被存储。每个一系列图像将被保存在这个独立的文件夹中的主文件夹，根据子叶进入阵地的命令按顺序编号。
14. 转到“捕获时间控制”选项卡，并设置图像采集的时间间隔和图像采集周期的总数。图片通常是收集每个小时为100小时，产生良好定义的基因表达谱。
15. 图像采集开始通过点击“运行时间表！”在位于“位置的时间表”标签的按钮。
16. 在100小时的图像采集，传输从进一步的图像分析任何大容量硬盘驱动器或计算机控制的机器人的计算机中的所有图像。高清晰度图像（1600 × 1200像素）收集为TIF文件测量〜5 MB每个。

四。图像分析

1. 组装100个连续的影像，从每个使用Adobe ImageReady中的文件夹。
   1. 打开ImageReady中导入所有的撰写一系列作为帧的序列图像。
   2. 调整原始图像的大小为800 × 600像素。收集到的图像分辨率高，产生大量的文件，它可以使图像处理速度慢。
   3. 滚动显示的图像，并找到一个点（S）在大部分图像中可见。
   4. 选定的现场（S）变焦高达300％。使用高倍率图像的对齐方式可以更精确的登记。
   5. 插入一个层上的所有图像上，并确保在所有帧中可见。标记使用“画笔”工具，在现场（S）的位置。
   6. 开始调整所有帧，使用“移动”工具，并到上一层作为参考标记。
   7. 当校准完成后，删除层用作参考，并保存为一个单一的“PSD”文件的影像。此外，出口作为一个单一的“MOV”文件中的所有帧，使用的最高分辨率。每个图像系列的手动对齐约需10分钟。
2. 使用ImageJ的基因表达进行量化。
   1. 在ImageReady中打开ImageJ软件和开放的“MOV”文件以前保存。
   2. 使用选择工具，选择一个400 × 300像素的面积和作物的形象。这个新的文件应保存为一个“AVI”文件。
   3. 连续的影像，在位于新的“AVI”文件分为红色，蓝色和绿色通道，点击“图像”，“色”和“RGB分裂”在ImageJ分开。
   4. 在绿色和红色通道的所有图像中减去背景荧光。使用绿色通道的图像系列，选择与非表达细胞从一个地区一个20 × 20像素的面积，并记录在“投资回报率管理器”工具，它的位置，所以，同样的面积将在选定的两个通道。 20 × 20像素的正方形活跃在绿色通道，位于ImageJ任务栏“插件”命令，然后点击“减去测得的投资回报率，为每个切片”工具插件。
   5. ImageJ，点击“图像”，“调整”，然后“门槛”来定义或段绿色荧光蛋白表达的像素。调整门槛窗口拖动栏获得的平均现货20-30像素大小的阈值水平。
   6. 确定GFP的表达，用我们设计了一个插件，来衡量每个像素的平均灰度值总数表达GFP的像素。
   7. 复制的平均输出ImageJ并粘贴到Microsoft Office Excel中的灰度值。每个通道（红色和绿色）乘以平均计算GFP表达灰度总数的每个像素值表达GFP的每个通道的像素。两个通道的总和表达式的值，给出了GFP的表达。值可以被用来说明基因表达谱，并进行直接的比较。定时动画也可以使用“MOV”或“AVI”文件，提供了一个独特的基因表达谱和清晰的可视化生成。

五，代表性的成果

该机器人的图像采集和分析过程（图1）这里允许的基因表达的定量数据，在很短的时间内大量收购。对于植物推广使用绿色荧光蛋白基因的特性，这种方法不仅是有用的创建瞬时表达谱（图2），而且还细致地表达GFP在瞬时和稳定的转化植物^组织 5,6跟踪。短的时间推移与收集到的序列图像生成的动画是基因表达的深入分析，在植物组织随时间的宝贵工具。这种方法也有很大的应用，以评估因素，直接影响基因的表达。例如，瞬时表达GFP沉默病毒的起源存在不同的抑制器下已经成功地使用我们的自动图像采集和分析^系统 7,8研究。

图1。图像分析过程包括四个主要步骤。 （a）收购的形象系列使用机器人的图像采集系统，（二）图像分离成红色，蓝色和绿色通道，（三）通过调整阈值水平的表达像素分割，和（d）获得的输出结果包含灰度值和绿色荧光蛋白表达的重点计数。

图2。图表显示不同的瞬时表达融合到 GFP的植物促销员驱动的配置文件。使用我们的机器人的图像采集系统收集的数据和ImageReady中ImageJ软件进行分析。

Discussion

使用的机器人在人类生活的不同方面的巨大应用，具体而言，机器人已经被有效地使用在危险的环境中执行的活动，自动化冗长而复杂的活动，并在一个更精确的的方式来进行任务。在分子生物学，特别是基因表达分析，机器人可以帮助跟踪不仅功能的基因，但也是组织的生长和发展随着时间的推移。许多生物的现象时有发生动态，这可能是难以遵循，使用单一的时间点观测。

使用绿色荧光蛋白基因表达的研究观测组织的响应和增长带来额外的好处。对于我们的实验程序，GFP让我们按照组织随着时间的推移同一块绿色荧光蛋白检测是一种非破坏性的基因表达。此外，我们的GFP蛋白的版本不够稳定，让检测，但也显示了一些营业额，以尽量减少在植物组织中的积累，使我们能够遵循的兴起和基因表达下降。

我们已经利用我们的机器人的图像采集和分析系统的广泛应用。我们预计所需的其中一个动态的理解的一种现象是，许多生物学应用潜力高。例如，植物组织的生长和发展，可以使用我们的系统提供了宝贵的见解/对这些过程的信息的跟踪。此外，使用GFP报告基因的蛋白质运输的动力，可以轻松地可视化，使用时间推移动画。在这份报告中所描述的方法在技术上是复杂的，但概念是很简单的。我们的结果是强大的和新的应用正在不断被发现。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
ImageJ	Software	National Institutes of Health		http://rsbweb.nih.gov/ij/