Summary
Мы сообщаем метод для внедрения, сопровождения и количественный анализ GFP выражение в клетках растений. Этот метод используется специально разработанная система для робототехники полунепрерывного коллекция изображений из большого количества образцов, с течением времени. Мы также продемонстрировать использование ImageJ и ImageReady для анализа изображений серии.
Protocol
Следующую методику контуров протокол для анализа изображений экспрессии генов с помощью автоматизированной системы сбора изображения. Для простоты объяснения, общий подход был разбит на четыре этапа: 1) подготовки семян, 2) введение гена использованием бомбардировки частицами, 3) робот коллекция изображений, и 4) анализ изображения. Хотя это общая методология может быть использована для широкого спектра других приложений, настоящее наборы протоколов основаны на использовании зеленого флуоресцентного белка (GFP) гена, который является полезным гена-репортера для отслеживания экспрессии генов в той же самой части живой ткани с течением времени.
И. подготовки семян
- Лима фасоль (. Phaseolus lunatus резюме Хендерсон-Буш) семена можно приобрести, или, в идеале собраны из растений, выращенных в ростовой камере (50% относительной влажности, 16 / 8 ч света: темные, 25/23 ° C день / ночь). Послеуборочной качества семян может поддерживаться за счет хранения семян при температуре -20 ° C.
- Подготовка пурпурный GA7 контейнеры для прорастания семян. Сложите фильтровальную бумагу или бумажные полотенца, чтобы поместиться в нижней части коробки пурпурный. Добавить ~ 25 мл деионизированной воды к каждому контейнеру, чтобы увлажнить бумажные полотенца, и слейте непоглощенной воды. Автоклав смоченной бумаги содержащих ящиков в течение 20 мин.
- Использование одноразовых 50 мл центрифужные пробирки, стерилизуют семена в 10% коммерческих отбеливающим раствором (20 семян в 20-40 мл) в течение 20 мин при встряхивании на шейкере вращательное при 60 оборотах в минуту.
Примечание: Все последующие шаги должны быть выполнены в ламинарном боксе. - Промойте семена 4-7 раз стерильной деионизованной воде с мягким агитации в течение 30 секунд во время каждого полоскания.
- Место 5-6 стерильные семена между слоями сложенной бумаги расположены в каждом стерильный бокс Magenta.
- Инкубируйте семена в течение 4 дней при следующих условиях: 25 ° C, 16 / 8 ч света: темные и 40 μEm -2 с -1.
II. Введение гена использованием бомбардировки частицами
- Сборка генные конструкции, используя ваш любимый вектор экспрессии с корреспондентом гена, который можно наблюдать в живых тканях. У нас разработаны высокие числа копий вектора экспрессии полезно для промоутера и анализирует промоутер элемента. Этот вектор содержит ген GFP, который используется для визуализации Промоутер / Промоутер элементом функции в трансформированных тканях.
- Около 1-2 часов до бомбардировки, акцизов Лимы семядоли компонента из прорастающих сеянцы и удалить семена пальто. Семядоли подходит для бомбардировки должны быть желтого до светло-зеленые, плоские и без каких-либо повреждений, которые могут помешать дальнейшему анализу изображений.
- Место семядоли на OMS культуральной среде, содержащей 1 MS солей, витаминов В5 2, 3% сахарозы и 0,2% Gelrite (рН 5,7) сразу же после того, как вырезали.
- Осадок ДНК-конструкции на M10 вольфрамовых частиц (Sylvania, Тованда, штат Пенсильвания, США). В 0,6 трубки микроцентрифужную мл, добавить 25 мкл частицы вольфрама (частиц ресуспендируют в стерильной воды, 100 мг мл -1, непосредственно перед использованием), 5 мкл ДНК (1 мкг мкл -1), 25 мкл 2,5 М хлорида кальция (Sigma -Aldrich Кат. C3881-500G) и 10 мкл 100 мМ спермидина (Sigma Кат. S-2626). Vortex кратко Тщательно перемешать все компоненты.
- Инкубируйте препарата ДНК на льду в течение 5 мин. Затем, удалить и уничтожить 50 мкл надосадочной жидкости.
- Ресуспендируют ДНК-частицы, покрытые по вортексе и немедленно удалить 2 мкл. Повторите этот шаг вортексе каждый раз аликвоту удаляется из трубки. Покрытые частицы должны иметь в лед и использовать в течение 15 мин.
- Через верхней части шприца фильтр, 2 место мкл частицы, покрытые в середине фильтра экрана. Место фильтр содержащие частицы, покрытые в фильтр проведение внутри камеры пушки частицы.
- Место фасоль лима семядолей адаксиальной вверх на перегородки и место перегородки в камеру пистолет частицы. Перегородкой, которая состоит из расплавленного экрана на дно стакана, используется в качестве платформы для поддержки ткани во время бомбардировки.
- Огонь тканей с использованием частиц Gun (в эту методологию, мы используем простой и недорогой пистолет частиц Приток 3, PIG, разработанный в нашей лаборатории) следующим образом: а) открыть вентиль, ведущих к вакуумной эвакуировать камере, б) после вакуум достигает 760 мм (30 дюймов) Hg, активировать соленоида и выпуска гелия для приведения в движение частиц, в) после бомбардировки частицами, закрыть клапан вакуумной линии и выпуск вакуумного использованием выпускной клапан. Давления гелия используется для ускорения частиц составляет 50 PSI.
- После вакуум освобождены, открытой двери камеры для получения бомбардировке семядоли и вернуться семядолей, адаксиальной стороной вверх, в культуральной среде OMS.
Примечание: Для количественной оценки и выражения профилей, мы обычно бомбардируют минимум три семядоли для каждого ДНК-конструкции. Положительный контроль, который обычно ДНКконструкция, которая дает хорошо изученный профиль экспрессии генов, включена в качестве ссылки.
III. Автоматизированный сбор Изображение
- Включите ртутную лампу и подождите 30 мин для прогрева лампы.
- Включите источники питания для Spot-RT CCD камера (диагностические инструменты Inc, Стерлинг Хайтс, Мичиган, США) и платформы робототехники контроллер двигателя, который приводит в движение платформы робототехники.
- Установить набор фильтров для GFP обнаружения (GFP2 набор фильтров;.. Ex 480/40 нм, Em 510 LP) на MZFLIII рассекает микроскопа (Leica, Heerbrugg, Швейцария).
- Стерилизовать утолщенные крышки поликарбоната чашку Петри, обливая их 70% этанола. Специализированные крышки, используются для покрытия базы чашку Петри предотвращения образования конденсата во время коллекция изображений 4.
- Место чашки, содержащие бомбардировке семядоли на платформе робототехники (Robotics Arrick, Херст, штат Техас, США) автоматизированной системы сбора изображения. Платформа робототехники приводится в движение шаговым двигателем набора и состоит из стола для крепления 8 чашках Петри. Платформа изготовлена из поликарбоната, полипропилена и алюминия. Плиты крепятся в положении, затянув боковых пластиковых установки винта.
- Откройте пользовательское приложение программное обеспечение, которое управляет как платформа робототехники и получения изображений. Кроме того, открытое программное обеспечение белый переключатель Контроллер света.
- В "мотор движения" на вкладке, нажмите на кнопку "мотор на" и "дом на колесах". После установки программного обеспечения ориентирует платформы в исходное положение, мы готовы, чтобы начать ввод позиции для каждого семядоли.
- В "мотор движения", выберите первую пластинку. Платформа будет позиционировать центр чашки Петри под цель микроскопом. Использование кнопки перемещения расстоянии, точно позиционировать первых семядолей для коллекции изображений. С белого света на контроллер, целевом регионе можно наблюдать через монитор компьютера, включив "живом режиме" функцию.
- Для первых семядолей, установить фокус и увеличение (увеличение с коэффициентом 1,6 предпочтительнее) с использованием ручной ручки на вскрытии микроскопом. Фокус корректировки для остальных семядоли на той же пластинке сделаны с помощью трех подъемных винтов расположены под каждой пластиной, на платформе робототехники.
- Как только интересующей нас области был установлен, нажмите кнопку "добавить эту позицию" кнопку. Программное обеспечение будет добавить координаты этой области в файл график позиции и платформы вернется в центре пластины.
- Установить и устанавливает фокус для всех остальных семядоли на пластинах использованием движущихся кнопки расстояния и ручной винта выравнивания. После того как все координаты всех семядоли были введены, сохранить координаты позиции графику.
- Введите параметры изображения коллекции. В "настройки изображения", выберите тип света желаемого, белый или синий. Для обнаружения GFP, только синий свет должен быть использован. Кроме этого, введите значение экспозиции. Хотя мы можем изменять время экспозиции отдельно для красного, синего и зеленого цвета, мы как правило, используют те же настройки для GFP фото-документации (20, 14 и 14 сек для красного, зеленого и синего каналов, соответственно), что позволяет нам сделать прямое и последовательное сравнение между различными конструкциями ДНК.
- В том же "настройки изображения" на вкладке, укажите пустую папку, в которой изображение будет сохранено. Каждая серия изображения будут сохранены в папке этого мастера в независимых папок, пронумерованных последовательно в соответствии с порядком должности введены для семядолей.
- К "время захвата контроля" вкладки и установите время изображение интервал приобретения и общее количество циклов коллекции изображений. Изображения обычно собираются каждый час в течение 100 ч, создавая четко определенных профилей экспрессии генов.
- Начало захвата изображения, нажав на кнопку "Выполнить график!" кнопку, расположенную в "позицию графика" на вкладке.
- В конце 100 коллекцию изображений ч, передачи всех изображений с компьютера управления роботом любой большой емкости жесткого диска или компьютер для дальнейшего анализа изображений. Изображения с высоким разрешением (1600 x 1200 пикселей) собираются, как TIF файлы размером ~ 5 Мб каждый.
IV. Анализ изображений
- Соберите 100 последовательных изображений от каждой папке с помощью Adobe ImageReady.
- Откройте ImageReady и импорт всех последовательных изображений составлении серии, как кадры.
- Изменение размера исходных изображений до 800 х 600 пикселей. Сборник изображений с высоким разрешением, который генерирует большие файлы, которые могут сделать обработку изображений медленно.
- Прокрутка изображения и найти место (ы) видна в большинстве изображений.
- Зум до 300% на выбранном месте (ах). Выравнивание изображений с помощью лупы с большим увеличением позволяет более точно регистрации.
- Вставьте слой поверх всех изображений и убедитесь, что видна во всех кадрах. Марк месте (ы) местоположение с помощью "кисти" инструмент.
- Начало выравнивания всех кадров с помощью "двигаться" инструментом и с отметинами на слой в качестве эталона.
- Когда выравнивание завершено, удалить слой используется в качестве эталонной и сохранения изображений в качестве сингла "Фотошоп" файл. Кроме того, экспортировать все кадры как сингл "мов" файл, используя высокое разрешение. Руководство выравнивание каждого изображения серия занимает ~ 10 мин.
- Выполнить количественную оценку экспрессии генов использованием ImageJ.
- Открытое ImageJ программного обеспечения и открытых "мов" файл, сохраненный ранее в ImageReady.
- Использование выбрать инструмент, выбрать 400 х 300 пикселей область и обрезать изображения. Этот новый файл должен быть сохранен как "AVI" файлов.
- Отдельные последовательных изображений, расположенных в новых "AVI" файл в красный, синий и зеленый каналы, нажав кнопку "Изображение", "цвет" и "RGB раскол" в ImageJ.
- Вычтите фоновой флуоресценции из всех изображений в зеленый и красный каналы. Использование зеленой серии канала изображения, выбрать 20 х 20 пикселей площадью от региона с не-клеток, экспрессирующих и записывать его расположение в "ROI Manager" инструментом, так что же районе будут выбраны в обоих каналах. С 20 х 20 пикселей квадратных активное участие в зеленый канал, перейдите в "Плагины" Команда находится в панели задач ImageJ и нажмите на "вычесть измерять ROI за каждый кусочек" плагина-инструмента.
- В ImageJ, нажмите кнопку "Изображение", "настройки" и затем "порог" для определения или сегмент GFP-экспрессирующих пикселей. Настройка пороговых значений, перетащив бар в порог окно, чтобы получить средний размер пятна на 20-30 пикселей.
- Определите GFP выражение, используя плагин, который мы разработали для измерения среднего значения градаций серого на пиксель и общее количество GFP-экспрессирующих пикселей.
- Копирование означать выход оттенки серого значений в ImageJ и вставить в Microsoft Office Excel. Рассчитать GFP выражение для каждого канала (красный и зеленый) путем умножения среднего значения градаций серого на пиксель на общее количество GFP-экспрессирующих пикселей для каждого канала. Сумма выражения значения для обоих каналов дает GFP выражения. Значения могут быть использованы для иллюстрации профили экспрессии генов и делать прямые сравнения. Покадровый анимации также может быть создан с помощью "мов" или "AVI" файлов, обеспечивая уникальную и ясно визуализация профиля экспрессии генов.
Результаты В. представитель
Коллекция роботов и анализа изображений процедуры (рис. 1) сообщили здесь позволяет приобретение большого количества количественных данных на экспрессию генов в короткий период времени. Для завода промоутер характеристика использованием гена GFP, эта методика не только полезно для создания переходных профилей выражении (рис. 2), но и отслеживать в детального образом GFP выражение в скоротечно и стабильно трансформированных растительных тканей 5,6. Короткие покадровой анимации, созданные с собранной последовательных изображений являются ценным инструментом для углубленного анализа экспрессии генов с течением времени в тканях растений. Эта методика также имеет большое применение для оценки факторов, которые непосредственно влияют на экспрессию генов. Например, преходящее выражение GFP при наличии разных супрессоров подавления вирусного происхождения успешно изучались с помощью нашего автоматического сбора и анализа изображений системы 7,8.
Рисунок 1. Анализ изображений процедура состоит из четырех основных шагов. () Приобретение изображения ряда с использованием робота системы сбора изображений, (B) разделения изображения в красном, синем и зеленом каналах, (C) сегментация выражения пикселей путем корректировки пороговых уровней, и (D) получение вывода результатов содержащие оттенки серого ценностей и GFP-экспрессирующих фокус подсчета.
Рисунок 2. График различные переходные профили выражении обусловлен завод промоутеров, слитый с GFP. Данные были собраны с помощью нашего робота системы сбора изображений и проанализированы с помощью ImageReady и ImageJ программного обеспечения.
Discussion
Использование робототехники имеет огромное применение в различных аспектах человеческой жизни, а именно, роботы были эффективно использованы для осуществления деятельности в опасных условиях, автоматизировать утомительные и сложные виды деятельности, а также для выполнения задач в более точным способом. В молекулярной биологии, и, в частности анализ экспрессии генов, роботы могут помочь отслеживать не только особенности генов, а также рост тканей и развития с течением времени. Многие биологические явления происходят динамически, что может быть трудно следить с помощью одного наблюдения указывают время.
Использование GFP ген выражения исследований приносит дополнительные преимущества для наблюдения реакции тканей и рост. Для наших экспериментальных процедур, GFP позволяет проследить экспрессии генов в тот же кусок ткани с течением времени, как GFP обнаружения неразрушающий. Кроме того, наша версия белка GFP в стране достаточно стабильна, чтобы обнаружить, но и показывает некоторые оборота, чтобы минимизировать накопление в тканях растений, что позволяет нам следить как взлет и падение экспрессии генов.
Мы уже использовали нашу коллекцию роботов и анализа изображений системы для широкого спектра приложений. Мы предвидим большой потенциал для многих биологических применений, где динамическое понимание феномена лучшего. Например, рост и развитие растительных тканей можно отслеживать с помощью нашей системы дает ценную информацию / сведения об этих процессах. Кроме того, динамика белков транспорта с использованием репортер гены, как GFP, могут быть легко визуализированы использованием покадровой анимации. Методологии, описанной в настоящем докладе, является технически сложным, но концептуально проста. Наши результаты являются надежными и новые приложения постоянно обнаруживаются.
Acknowledgments
Заработная плата и поддержка научных исследований были предоставлены Советом Соединенных сои, а также государственных и федеральных средств, выделяемых в Университете штата Огайо / Ohio сельскохозяйственных исследований и развития центра. Это исследование было также частично поддерживается общение с КОНАСИТ, Мексику, чтобы CMHG. Упоминание о товарных знаках или патентованных продуктов не является гарантией или гарантией продукта ОГУ / OARDC, а также не подразумевает одобрение исключения других продуктов, которые также могут быть пригодны. Журнальная статья Нет ЖКХ 09-17.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageJ | Software | National Institutes of Health | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
References
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 15, 473-497 (1962).
- Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp Cell Res. 50, 150-158 (1968).
- Finer, J. J., Vain, P., Jones, M. W., McMullen, M. D. Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells. Plant Cell Rep. 11, 232-238 (1992).
- Finer, J. E., Finer, J. J. A simple method for reducing moisture condensation on Petri dish lids. Plant Cell Tiss Org. 91, 299-304 (2007).
- Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. Comparative analysis of 35S and Lectin promoters in transgenic soybean tissue using an automated image acquisition system and image analysis. Plant Cell Rep. 25, 290-296 (2006).
- Chiera, J. M., Bouchard, R. A., Dorsey, S. L., Park, E. H., Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. Isolation of two highly active soybean (Glycine max (L.) Merr.) promoters and their characterization using a new automated image collection and analysis system. Plant Cell Rep. 26, 1501-1509 (2007).
- Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. Quantification and extension of transient GFP expression by the co-introduction of a suppressor of silencing. Transgenic Res. 17, 1143-1154 (2008).
- Dhillon, T., Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. Quantitative evaluation of six different viral suppressors of silencing using image analysis of transient GFP expression. Plant Cell Rep. 28, 639-647 (2009).
