Summary
Riportiamo un metodo per l'introduzione, il monitoraggio e l'analisi quantitativa di espressione GFP nelle cellule vegetali. Questo metodo utilizza un sistema progettato su misura per la robotica semi-continua raccolta di immagini da un gran numero di campioni, nel corso del tempo. Abbiamo anche dimostrare l'uso di ImageJ e ImageReady per l'analisi delle serie di immagini.
Abstract
Espressione genica nei tessuti vegetali è tipicamente studiato per estrazione distruttiva di composti da tessuti vegetali per
Protocol
La metodologia che segue delinea un protocollo per l'analisi delle immagini di espressione genica utilizzando un sistema automatizzato di raccolta di immagini. Per semplicità di spiegazione, l'approccio globale è stato suddiviso in quattro fasi: 1) la preparazione di semi, 2) introduzione del gene mediante bombardamento di particelle, 3) raccolta di immagini robotica, e 4) l'analisi delle immagini. Anche se questa metodologia generale può essere utilizzata per un'ampia gamma di altre applicazioni, la serie attuale di protocolli sono basati sull'utilizzo della proteina fluorescente verde (GFP) del gene, che è un gene reporter utile per l'espressione genica di tracciamento nello stesso pezzo di tessuti viventi nel tempo.
I. Preparazione Seed
- Fagiolo di Lima (. Phaseolus lunatus cv Henderson-Bush), i semi possono essere acquistati, o idealmente raccolto da piante coltivate in una camera di crescita (50% di umidità relativa, 16 / 8 h luce: buio, 25/23 ° C giorno / notte). Post-raccolta di semi di qualità può essere mantenuta da semi di stoccaggio a -20 ° C.
- Preparare Magenta GA7 contenitori per la germinazione dei semi. Piegare la carta filtro o salviette di carta in base al fondo di scatole di Magenta. Aggiungere circa 25 ml di acqua deionizzata a ogni contenitore per inumidire asciugamani di carta, e versare l'acqua non assorbita. Autoclave inumidito carta contenente scatole per 20 min.
- Con 50 ml provette per centrifuga monouso, sterilizzare i semi in una soluzione al 10% di candeggina commerciale (20 semi in ml 20-40) per 20 minuti con agitazione su un agitatore rotatorio a 60 giri.
Nota: Tutti i passi successivi devono essere eseguiti in una cappa a flusso laminare. - Lavare i semi 4-7 volte con acqua deionizzata sterile scuotendo con cautela per 30 secondi durante ogni lavaggio.
- Luogo 5-6 semi sterili tra gli strati di carta piegato trova in ogni casella Magenta sterile.
- Incubare i semi per 4 giorni alle seguenti condizioni: 25 ° C, 16 / 8 h luce: buio e 40 μEm -2 s -1.
II. Gene Introduzione con bombardamento di particelle
- Costruire costrutti del gene utilizzando il vettore preferito espressione con un gene reporter che possono essere monitorati nei tessuti viventi. Abbiamo progettato un elevato numero di copie vettore di espressione utile per promotore e analisi elemento promotore. Questo vettore contiene il gene GFP che viene utilizzato per visualizzare promotore / Funzione di un elemento promotore nei tessuti trasformati.
- Circa 1-2 ore prima del bombardamento, accise Lima cotiledoni fagiolo di germinare piantine e togliere i cappotti seme. Cotiledoni adatto per bombardamento dovrebbe essere giallo al verde chiaro, piana e priva di qualsiasi danno che possa interferire con l'analisi delle immagini ulteriormente.
- Cotiledoni luogo il terreno di coltura contenente sali OMS MS 1, vitamine B5 2, 3% di saccarosio e 0,2% Gelrite (pH 5,7) subito dopo essere stato asportato.
- Precipitare il DNA costruire sulla M10 particelle di tungsteno (Sylvania, Towanda, PA, USA). In un tubo microcentrifuga 0,6 ml, aggiungere 25 microlitri di particelle di tungsteno (le particelle sono risospeso in acqua sterile, 100 mg ml -1, a destra prima dell'uso), 5 microlitri di DNA (1 mcg microlitri -1), 25 microlitri 2,5 M di cloruro di calcio (Sigma Cat-Aldrich. C3881-500G) e 10 microlitri 100 mM spermidina (Cat Sigma. S-2626). Vortex brevemente per mescolare completamente tutti i componenti.
- Incubare la preparazione del DNA in ghiaccio per 5 min. Poi, rimuovere e scartare il surnatante 50 microlitri.
- Risospendere il DNA particelle rivestite con vortex e rimuovere immediatamente un 2 aliquota microlitri. Ripetere questa operazione vortex ogni volta che viene rimosso un'aliquota dal tubo. Particelle rivestite devono essere conservati in ghiaccio e utilizzato entro 15 minuti.
- Attraverso la parte superiore di un filtro a siringa, si introducono 2 particelle microlitri rivestito nel centro dello schermo filtro. Posizionare l'unità filtro contenente le particelle rivestito nell'unità tenendo filtro all'interno della camera di pistola particelle.
- Posizionare un fagiolo di Lima lato adaxial cotiledone su un deflettore e posizionare il deflettore nella camera di pistola particelle. Il deflettore, che consiste in uno schermo sciolto al fondo di un bicchiere, è utilizzato come piattaforma per supportare i tessuti durante i bombardamenti.
- Bombardano i tessuti utilizzando una pistola particelle (in questa metodologia, usiamo un semplice e poco costoso Gun afflusso particelle 3, PIG, progettata nel nostro laboratorio) come segue: a) aprire la valvola che conduce al vuoto di evacuare la camera, b) dopo il vuoto raggiunge i 760 mm (30 in) Hg, attivare il solenoide e rilasciare l'elio per spingere le particelle, c) dopo il bombardamento di particelle, chiudere la valvola della linea del vuoto e il vuoto d'aria con la valvola di scarico. La pressione dell'elio utilizzato per accelerare le particelle è di 50 PSI.
- Dopo il vuoto viene rilasciato, aprire la porta della camera per recuperare i cotiledoni bombardato e restituire il, lato adaxial cotiledone alto, alla cultura medio OMS.
Nota: Per la quantificazione e profilo di espressione, di solito bombardare un minimo di tre cotiledoni per ogni DNA costruire. Un controllo positivo, che di solito è un DNAcostrutto che dà un ben studiato il profilo di espressione genica, è incluso come riferimento.
III. Immagine di raccolta automatizzata
- Accendere la lampada al mercurio e attendere 30 minuti per la lampada si riscaldi.
- Accendere l'alimentazione dei Spot-RT CCD (Diagnostic Instruments Inc., Sterling Heights, MI, USA) e la piattaforma robotica di controllo motore, che aziona il movimento della piattaforma di robotica.
- Impostare il set di filtri per il rilevamento di GFP (GFP2 filtro impostato;.. Ex nm 480/40, Em 510 LP) su un microscopio MZFLIII dissezione (Leica, Heerbrugg, Svizzera).
- Sterilizzare il addensato in policarbonato coperchi Petri a spruzzo con il 70% di etanolo. I coperchi specializzati, utilizzati per coprire la base piastra di Petri evitare la condensa durante la raccolta di immagini 4.
- Posizionare le piastre contenenti cotiledoni bombardato sulla piattaforma robotica (Arrick Robotica, Hurst, TX, USA) del sistema automatizzato di raccolta di immagini. La piattaforma robotica è guidata da un gruppo motore passo-passo e si compone di un tavolo per il fissaggio di 8 piastre di Petri. La piattaforma è costruita in policarbonato, polipropilene e alluminio. Le piastre sono fissate in posizione serrando una plastica laterale vite di fissaggio.
- Aprire l'applicazione software personalizzato che controlla sia la piattaforma robotica e l'acquisizione di immagini. Inoltre, aprire il software bianco interruttore di controllo della luce.
- Nella "mozione motore" scheda, fare clic su "motore" e "camper". Dopo che il software orienta la piattaforma nella posizione iniziale, siamo pronti per iniziare a inserire le posizioni per ogni cotiledone.
- Nel "movimento del motore", selezionare il primo piatto. La piattaforma si posizionerà al centro della scatola di Petri nell'ambito dell'obiettivo del microscopio. Utilizzando i pulsanti di distanza in movimento, proprio la posizione del cotiledone prima raccolta di immagini. Con il controller di luce bianca, la regione di destinazione può essere osservata attraverso il monitor del computer attivando la "modalità live" caratteristica.
- Per il cotiledone prima impostare la messa a fuoco e ingrandimento (ingrandimento 1,6 x è preferibile) utilizzando le manopole manuale sul microscopio da dissezione. Concentrare le regolazioni per i cotiledoni rimasti sulla stessa lastra sono realizzati con tre viti calanti posizionato sotto ciascun piatto, sulla piattaforma robotica.
- Una volta che la regione di interesse è stata impostata, fare clic sul pulsante "aggiungi questa posizione". Il software si aggiungono le coordinate di questa regione in un file di pianificazione posizione e la piattaforma torna al centro del piatto.
- Impostare le posizioni e punto di riferimento per tutti i cotiledoni rimasti su piatti utilizzando i pulsanti di distanza in movimento e le viti di livellamento manuale. Dopo tutte le coordinate di tutti i cotiledoni sono stati inseriti, salvare le coordinate di posizione programma.
- Immettere i parametri dell'immagine raccolta. Nella "creazione dell'immagine", selezionare il tipo di luce desiderata, bianco o blu. Per il rilevamento GFP, solo la luce blu dovrebbe essere usato. Inoltre, immettere le impostazioni di esposizione. Anche se siamo in grado di modificare il tempo di esposizione in modo indipendente per il colore rosso, blu e verde, che in genere utilizzano le stesse impostazioni per GFP la documentazione fotografica (20, 14 e 14 sec per canali rosso, verde e blu, rispettivamente) che ci permette di fare diretto e confronto costante tra costrutti del DNA diversi.
- Nella stessa "impostazione immagine" sulla scheda, specificare una cartella vuota dove le immagini vengono memorizzate. Ogni serie di immagini saranno salvate all'interno di questa cartella master in cartelle indipendenti, numerati in sequenza secondo l'ordine di posizioni sono assunte per cotiledoni.
- Vai alla sezione "tempo di acquisizione di controllo" scheda e impostare l'intervallo di acquisizione di immagini in tempo e il numero totale di cicli di raccolta di immagini. Le immagini vengono in genere raccolti ogni ora per 100 ore, generando ben definiti profili di espressione genica.
- Avviare l'acquisizione di immagini cliccando sulla "pianificazione di esecuzione!" pulsante che si trova nel "programma di posizione" sulla scheda.
- Al termine della raccolta h 100 immagini, trasferire tutte le immagini dal computer di controllo del robot a qualsiasi unità di grande capacità rigido o computer per l'analisi delle immagini ulteriormente. Immagini ad alta risoluzione (1600 x 1200 pixel) sono raccolti sotto forma di file TIF misura ~ 5 Mb ciascuna.
IV. Analisi dell'immagine
- Assemblare la 100 immagini in sequenza da ciascuna cartella utilizzando Adobe ImageReady.
- Aperto ImageReady e importare tutte le immagini in sequenza che compongono una serie di fotogrammi.
- Ridimensionare le immagini originali a 800 x 600 pixel. Immagini raccolte sono ad alta risoluzione, che genera file di grandi dimensioni che possono rendere l'elaborazione delle immagini lento.
- Scorrere le immagini e trovare un punto (s), visibile nella maggior parte delle immagini.
- Zoom fino al 300% sul posto scelto (s). Allineamento delle immagini con un ingrandimento maggiore consente una registrazione più precisa.
- Inserire uno strato sopra di tutte le immagini e fare sicuramente visibile in tutti i fotogrammi. Segnare la (s) posizione posto con lo strumento "pennello".
- Avviare l'allineamento tutti i fotogrammi con lo strumento "sposta" e prendendo i segni sullo strato come riferimento.
- Quando l'allineamento è completo, cancellare il livello utilizzato come riferimento e salvare le immagini come un unico file "psd". Inoltre, esportare tutti i fotogrammi come un unico file "mov" con la più alta risoluzione. Allineamento manuale di ogni serie di immagini si ~ 10 min.
- Eseguire quantificazione dell'espressione genica utilizzando ImageJ.
- Software open ImageJ e aprire il file "mov" salvato in precedenza in ImageReady.
- Utilizzando lo strumento di selezione, scegliere una zona x 400 300 pixel e ritagliare l'immagine. Questo nuovo file dovrebbe essere salvato come file "avi".
- Separare le immagini in sequenza, che si trova nel nuovo file "avi" in canali rosso, blu e verde, cliccando su "immagine", "colore" e "Split RGB" in ImageJ.
- Sottrarre la fluorescenza di fondo di tutte le immagini nei canali verde e rosso. Utilizzando la serie verde immagine del canale, selezionare una zona di 20 x 20 pixel da una regione con i non-cellule che esprimono e registrare la sua posizione nel "Manager ROI" strumento, in modo che la stessa area saranno selezionati in entrambi i canali. Con il quadrato di 20 x 20 pixel attivi nel canale verde, andare al comando "plugins" che si trova nella barra delle applicazioni di ImageJ e quindi fare clic su "ROI sottrarre misurati per ogni sezione" plug-tool.
- In ImageJ, cliccare su "Immagine", "regolare" e poi "soglia" per definire il segmento o GFP-esprimere pixel. Regolare i livelli di soglia trascinando la barra della finestra soglia di ottenere una dimensione media macchia di 20-30 pixel.
- Determinare l'espressione GFP utilizzando un plugin che abbiamo progettato per misurare il valore di grigio medio per pixel e il numero totale di GFP che esprimono pixel.
- Copiare l'uscita significano i valori in scala di grigi ImageJ e incolla in Microsoft Office Excel. Calcolare l'espressione della GFP per ogni canale (rosso e verde) moltiplicando la media valore di grigio per pixel per il numero totale di GFP-esprimere pixel per ogni canale. La somma dei valori di espressione per entrambi i canali dà l'espressione GFP. I valori possono essere utilizzati per illustrare profili di espressione genica e fare confronti diretti. Time-lapse animazioni possono essere anche generati utilizzando "mov" e "avi" file, che fornisce una visualizzazione unica e chiara del profilo di espressione genica.
V. Rappresentante Risultati
La raccolta di immagini robotica e Procedura per l'analisi (Fig. 1) qui riportata permette l'acquisizione di una grande quantità di dati quantitativi sulla espressione genica in un breve periodo di tempo. Per la caratterizzazione dell'impianto promotore utilizzando il gene GFP, questa metodologia non solo è utile per creare profili di espressione transitoria (Fig. 2), ma anche di tenere traccia in modo dettagliato, espressione di GFP in transitoriamente e tessuti vegetali stabilmente trasformato 5,6. Breve time-lapse animazioni generate con le immagini raccolte in sequenza sono uno strumento prezioso per approfondite analisi di espressione genica nel tempo nei tessuti vegetali. Questa metodologia ha anche grande applicazione per valutare i fattori che influenzano direttamente l'espressione genica. Per esempio, l'espressione GFP transitoria sotto la presenza di diversi soppressori di silenziamento di origine virale è stato studiato con successo usando la nostra raccolta automatica delle immagini e sistema di analisi 7,8.
Figura 1. Procedura di analisi di immagine si compone di quattro fasi principali. (A) Acquisizione di serie di immagini utilizzando il sistema robotico raccolta di immagini, (B) separazione di immagini in canali rosso, blu e verde, (C) segmentazione dei pixel che esprime regolando i livelli di soglia, e (D) ottenendo i risultati di uscita contenente i valori in scala di grigi e la GFP che esprimono conteggio fuoco.
Figura 2. Grafico che mostra diversi profili di espressione transiente guidati da promotori impianto fuso a GFP. I dati sono stati raccolti utilizzando il nostro sistema robotico raccolta di immagini e analizzati con ImageReady e software ImageJ.
Discussion
L'uso della robotica ha enormi applicazioni in diversi aspetti della vita umana, in particolare, i robot sono stati effettivamente utilizzati per svolgere attività in ambienti pericolosi, per automatizzare le attività noiose e complesse, e di svolgere compiti in modo più preciso. In biologia molecolare, ed in particolare le analisi di espressione genica, i robot possono contribuire a tracciare non solo le caratteristiche dei geni, ma anche la crescita dei tessuti e lo sviluppo nel tempo. Molti fenomeni biologici avvengono in modo dinamico, che può essere difficile da seguire con singolo punto di osservazione del tempo.
L'uso del gene GFP per studi di espressione apporta ulteriori vantaggi per l'osservazione di risposta dei tessuti e la crescita. Per le nostre procedure sperimentali, GFP ci permette di seguire l'espressione genica nello stesso pezzo di tessuto nel corso del tempo il rilevamento GFP è un non-distruttiva. Inoltre, la nostra versione della proteina GFP è sufficientemente stabile da consentire il rilevamento, ma mostra anche alcune fatturato di ridurre al minimo l'accumulo nei tessuti vegetali, che ci permette di seguire sia l'ascesa e la caduta di espressione genica.
Abbiamo già utilizzato nostra collezione robotico immagine e sistema di analisi per una vasta gamma di applicazioni. Si prevede un elevato potenziale per molte applicazioni biologiche in cui si desidera una comprensione dinamica di un fenomeno. Per esempio, la crescita e lo sviluppo dei tessuti vegetali si possono seguire con il nostro sistema dando informazioni preziose / informazioni su questi processi. Inoltre, la dinamica del trasporto di proteine utilizzando geni reporter come GFP, possono essere facilmente visualizzati utilizzando time-lapse animazioni. La metodologia descritta in questo rapporto è tecnicamente complessa ma concettualmente semplice. I nostri risultati sono robusti e nuove applicazioni vengono continuamente scoperti.
Acknowledgments
Salari e sostenere la ricerca sono stati forniti dal Consiglio soia Uniti, e da fondi statali e federali stanziati per la Ohio State University / Ohio ricerca agricola e Centro Sviluppo. Questa ricerca è stata anche parzialmente sostenuto da una borsa di studio CONACYT, Messico, a cmHg. La citazione di marchi o prodotti di proprietà non costituisce una garanzia o garanzia del prodotto da OSU / OARDC e inoltre non comporta l'approvazione ad esclusione di altri prodotti che possono anche essere adatto. Gazzetta articolo non HCS 09-17.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageJ | Software | National Institutes of Health | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
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