Summary
우리는 소개, 추적 및 식물 세포에서 GFP의 표현의 정량 분석에 대한 방법을보고합니다. 이 방법은 시간이 지남에 샘플을 다수의 세미 연속 이미지 수집을위한 맞춤 설계된 로봇 시스템을 사용합니다. 우리는 또한 이미지 시리즈의 분석 ImageJ와 ImageReady의 사용을 보여줍니다.
Abstract
식물 조직의 유전자 발현은 일반적으로에 대한 식물의 조직에서 화합물의 파괴 추출하여 공부합니다
Protocol
다음 방법론은 자동 이미지 수집 시스템을 사용하여 유전자 발현의 이미지 분석을 위해 프로토콜을 설명합니다. 설명의 편의를위한, 전반적인 접근 방법은 네 단계로 나눠되었다 : 1) 종자 준비, 2) 유전자 도입을 입자 충격, 3) 로봇 이미지를 수집하고, 4) 이미지 분석을 사용합니다. 이 일반적인 방법론이 다른 어플 리케이션의 넓은 범위에 사용할 수 있지만, 프로토콜의 현재 세트 같은 작품에서 추적 유전자 발현에 대한 유용한 리포터 유전자는 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자의 사용에 기반 시간이 지남에 따라 생활의 조직.
I. 시드 준비
- 리마콩 (. Phaseolus lunatus CV 헨더슨 - 부시) 씨를 구입, 또는 이상 성장 챔버의 재배 식물 (50 % 상대 습도, 8분의 16 H 조명 : 어두운, 23분의 25 ° C 주 / 야)에서 수확 수 있습니다. 수확 후 종자의 품질은 -20 ° C.에 저장 종자에 의해 유지 수 있습니다
- 씨를 germinating위한 마젠타 GA7 용기를 준비합니다. 폴드 필터 종이 또는 종이 타올 마젠타 상자의 하단에 들어갈 수 있습니다. 종이 타월을 축축하게하다, 그리고 unabsorbed 물을 부어 각 컨테이너에 ~ 25 ML 탈이온수를 추가합니다. 압력솥 20 분 종이가 들어있는 상자를 moistened.
- 50 ML 일회용 원심 분리기 튜브를 사용하여, 60 RPM에서 자이 러 토리 쉐이크에 떨고있는 20 분 10 % 상용 표백 용액 (20-40 ML 20 씨앗)의 종자를 소독.
참고 : 이후의 모든 단계가 층류 후드에서 수행되어야합니다. - 각 린스 중 30 초에 대한 부드러운 교반과 멸균 탈이온수와 씨앗에게 4-7 번 씻어.
- 각 멸균 마젠타 상자에있는 접힌 종이의 층 사이에 5-6 살균 씨앗을 놓으십시오.
- 25 ° C, H 빛을 8분의 16 : 어두운 40 μEm -2 -1의 다음과 같은 조건에서 4 일간 씨를 품어.
II. 입자 충돌을 사용하여 유전자 소개
- 생활 조직에서 모니터링할 수 있습니다 리포터 유전자로 좋아하는 발현 벡터를 사용하여 유전자 구조를 빌드합니다. 우리는 모터와 모터 요소 분석을위한 높은 사본 번호 발현 벡터 유용한 설계했습니다. 이 벡터는 프로 모터 / 변형 조직에 발기인 요소 기능을 시각화하는 데 사용되는 GFP의 유전자를 포함하고 있습니다.
- 1-2 주변 모종을 germinating에서 폭격, 엑사이스 리마 콩 cotyledons 전에 H와 종자 외피를 제거합니다. 충격에 적합 Cotyledons은 녹색 평면 및 추가 이미지 분석에 방해가 수있는 손상을 무료로 빛을 노란색해야합니다.
- MS 소금 1, B5 비타민 2, 즉시 excised 후 3 % 자당 및 0.2 % Gelrite (산도 5.7)이있는 OMS 문화 매체에 플레이스 cotyledons.
- DNA가 M10 텅스텐 입자 (실바니아, 토완다, PA, 미국)에 구축 침전물. 0.6 ML의 microfuge 관에서, 25 μl 텅스텐 입자 (입자가 바로 사용하기 전에, 멸균 물, 100 MG ML -1에 resuspended됩니다) 5 μl DNA (1 μg의 μl -1), 25 μl 2.5 M의 염화칼슘 (시그마를 추가 - 알드리치 고양이. C3881 - 500G) 10 μl 100 MM spermidine (시그마 고양이. S - 2626). 소용돌이 간략 모든 구성 요소를 철저를 혼합합니다.
- 5 분 얼음의 DNA 준비를 품어. 그런 다음 제거 50 μl 뜨는을 삭제.
- vortexing하여 DNA - 코팅 입자를 Resuspend 즉시 2 μl 나누어지는를 제거합니다. 이 vortexing 단계에게 나누어지는이 튜브에서 제거됩니다 때마다 반복합니다. 코팅 입자가 얼음에 보관하고 15 분 이내에 사용해야합니다.
- 필터 화면의 중간에 주사기 필터의 상단에, 장소를 통해 2 μl 코팅 입자. 입자 총 챔버 내부의 필터 지주 단위로 코팅된 입자를 포함하는 필터 장치를 놓습니다.
- 배플에 리마콩 떡잎 adaxial 측면을 놓고 입자 총 챔버에 배플을 놓습니다. 비커의 바닥에 녹아있는 화면으로 구성되어 있습니다 배플은, 폭격하는 동안 조직을 지원하는 플랫폼으로 사용됩니다.
- 입자 건 (이 방법에서 우리 연구실에 설계된 간단하고 저렴한 입자 인플로 건 3, 돼지를 사용)를 사용하여 충격 조직은 다음과;) 후 챔버 대피하기 위해 진공 이어지는 밸브, B)을 엽니다 진공 입자 충돌 후, 진공 라인 밸브를 닫고 배기 밸브를 사용하여 진공을 해제 760mm (30) HG, 솔레노이드를 활성화하고 입자를 추진하기 위해 헬륨을 출시, C)에 도달합니다. 입자를 가속하는 데 사용되는 헬륨 압력은 50 PSI입니다.
- 진공이 릴리스 후, 폭격을 cotyledons를 검색하고 OMS 문화 매체, 최대 떡잎, adaxial 측면을 반환합니다 챔버 문을 엽니다.
참고 : 부량와 표현 프로 파일링 들어, 우리가 일반적으로 모든 DNA 구조 세 cotyledons 최소 도배. 일반적으로 DNA는 긍정적인 관리,잘 공부 유전자 발현 프로필을 준 구축, 참조로 포함됩니다.
III. 자동 이미지 콜렉션
- 수은 램프를 켜고 따뜻하게하는 램프에 대해 30 분 기다립니다.
- 그 자리 - RT CCD 카메라 (진단먼트 주식 회사, 스털링 헤이츠, MI, 미국)과 로봇 플랫폼의 움직임을 드라이브 로봇 플랫폼 모터 컨트롤러에 대한 전원을 켭니다.
- MZFLIII 해부 현미경에 (Leica, Heerbrugg, 스위스), GFP 감지 (예 40분의 480 NM, 엠 510 LP.. GFP2 필터 설정)에 대한 필터 설정을 설정합니다.
- 70 % 에탄올로 분사하여 걸쭉하게 폴리 카보 네이트 페트리 접시의 뚜껑을 소독. 페트리 접시의 기본 이미지 모음 4 중 결로 방지 커버하는 데 사용되는 전문 뚜껑.
- 자동 이미지 수집 시스템의 로봇 플랫폼 (Arrick 로봇, 허스트, TX, 미국)에 폭격 cotyledons가 들어있는 접시를 놓습니다. 로봇 플랫폼은 스테핑 모터 세트에 의해 구동과 8 배양 접시의 첨부 파일 테이블로 구성되어있다. 플랫폼은 폴리 카보 네이트, 폴리 프로필렌과 알루미늄 구성되어 있습니다. 접시는 측면 플라스틱 세트 나사를 강화하여 위치에 고정됩니다.
- 로봇 플랫폼과 이미지 수집을 모두 제어하는 사용자 지정 소프트웨어 응용 프로그램을 엽니다. 또한, 소프트웨어 하얀 빛을 컨트롤러 스위치를 엽니다.
- "모터 모션 '탭에서'에 모터 '및'모터 홈"을 클릭하십시오. 소프트웨어가 홈 위치로 플랫폼을 orients 후, 우리는 모든 떡잎에 대한 위치를 입력 시작할 수 있습니다.
- "모터 모션 '탭에서, 첫 번째 접시를 선택합니다. 플랫폼은 현미경의 목표 아래 페트리 접시의 중앙에 위치합니다. 이동 거리 버튼을 사용하여 정확하게 이미지 컬렉션의 첫 번째 떡잎 위치를. 에 하얀 빛을 컨트롤러, 대상 지역은 "라이브 모드"기능을 설정하여 컴퓨터 모니터를 통해 볼 수 있습니다.
- 최초의 떡잎은 해부 현미경에 관한 매뉴얼 손잡이를 사용하여 초점과 배율 (1.6x 배율 선호)으로 설정합니다. 같은 접시에 남아있는 cotyledons에 대한 초점 조정은 로봇 플랫폼에서 각 접시 아래에있는 세 수평 나사를 사용하여 만들어집니다.
- 관심 영역이 설정되면, "이 위치 추가"버튼을 클릭하십시오. 소프트웨어는 위치 일정 파일에이 지역의 좌표를 추가하고 플랫폼 판의 중심으로 돌아갑니다.
- 위치를 설정하고 이동 거리 버튼과 수동 수평 나사를 사용하여 접시에 모든 나머지 cotyledons에 대해 중점을두고 있습니다. 모든 cotyledons의 모든 좌표가 입력되고 나면, 위치 일정 좌표를 저장합니다.
- 이미지 모음 매개 변수를 입력합니다. 흰색 또는 파란색, "이미지 설정"탭에서, 라이트 원하는 유형을 선택합니다. GFP 감지 들어, 푸른 불빛을 사용해야합니다. 또한, 노출 설정을 입력합니다. 우리가 빨강, 파랑과 녹색 색상 독립적으로 노출 시간을 수정할 수 있지만, 우리는 일반적으로 우리가 직접 만들 수 있도록 GFP 사진 문서 (20, 14 각각 빨간색, 녹색 및 파랑 채널, 14 초)에 대해 동일한 설정을 사용 다른 DNA 구조 사이에 일관성을 비교.
- 같은 "이미지 설정"탭에서 이미지가 저장됩니다 빈 폴더를 지정합니다. 이미지의 모든 시리즈는 cotyledons에 입력한 위치의 순서에 따라 순차적으로 번호가 독립 폴더에서이 마스터 폴더 내에 저장됩니다.
- "캡처 시간 관리 '탭으로 이동하여 이미지를 수집 시간 간격 및 이미지 수집주기의 총 수를 설정합니다. 이미지는 일반적으로 잘 정의 유전자 발현 프로파일을 생성, 100 H에 대해 매 시간마다 수집하고 있습니다.
- 클릭하여 이미지 획득을 시작 "실행 일정!" "위치 일정"탭에서에 위치한 버튼을 클릭합니다.
- 100 H 이미지 컬렉션의 끝에 추가 이미지 분석을위한 대용량 하드 드라이브 또는 컴퓨터로 로봇을 제어하는 컴퓨터에서 이미지를 전송합니다. 고해상도 이미지 (1600 X 1200 픽셀) ~ 5 MB 각을 측정 TIF 파일로 저장됩니다.
IV. 이미지 분석
- 어도비 ImageReady를 사용하여 각 폴더에서 100 순차 이미지를 조립.
- ImageReady를 열고 프레임으로 시리즈를 구성하는 모든 순차 이미지를 가져옵니다.
- 800 × 600 픽셀 원본 이미지 크기를 조정할 수 있습니다. 수집된 이미지가 이미지 처리가 느리 수 대용량 파일을 생성 고해상도입니다.
- 이미지 스크롤 대부분의 이미지에서 볼 수 자리 (들)을 찾습니다.
- 선택된 지점 (들)에는 300 %까지 확대할 수 있습니다. 높은 배율을 사용하여 이미지 정렬보다 정확한 등록하실 수 있습니다.
- 모든 이미지의 상단에 레이어를 삽입하고 있는지 모든 프레임에 표시됩니다하십시오. "페인트"도구를 사용하여 지점 (S) 위치를 표시합니다.
- "이동"도구를 사용하여 모든 프레임을 정렬하고 참조로 레이어의 흔적을 복용 시작합니다.
- 정렬이 완료되면, 참조로 사용되는 레이어를 삭제하고 단일 "PSD"파일로 이미지를 저장합니다. 또한, 가장 높은 해상도를 사용하여 단일 "MOV"파일로 모든 프레임을 내보낼 수 있습니다. 각 이미지 시리즈의 수동 정렬 ~ 10 분 정도 소요됩니다.
- ImageJ를 사용하여 유전자 발현의 부량을 수행합니다.
- 오픈 ImageJ 소프트웨어와 "MOV"파일을 열려면 ImageReady에서 이전에 저장한.
- 선택 도구를 사용하여 400 X 300 픽셀 지역 작물 이미지를 선택합니다. 이 새로운 파일은 "AVI"파일로 저장해야합니다.
- "이미지", "컬러"와 ImageJ에서 "RGB 분할"을 클릭하여 빨간색, 파란색 및 녹색 채널에 새로운 "AVI"파일에있는 순서대로 이미지를 분리합니다.
- 녹색과 적색 채널의 모든 이미지에서 배경 형광을 빼기. 녹색 채널 이미지 시리즈를 사용하지 않는 표현 전지와 지역의 20 X 20 픽셀 영역을 선택하고 같은 지역을 두 채널에서 선택되도록, '투자 수익 (ROI) 관리자 "도구의 위치를 기록합니다. 녹색 채널에 적극적인 20 X 20 픽셀 사각형으로 ImageJ의 작업 표시줄에있는 "플러그인"명령으로 이동 후 플러그인 - 도구 "각 슬라이스에 대한 투자 수익 (ROI) 측정 빼기"를 클릭하십시오.
- ImageJ에서 "한계"GFP - 표현 픽셀을 정의하거나 세그먼트에 다음 "조정", "이미지"를 클릭합니다. 20-30 픽셀의 평균 스폿 크기를 얻기 위해 임계값 창에서 막대를 드래그하여 임계값 수준을 조정합니다.
- 우리가 의미가 픽셀당 가치의 총 수를 GFP - 표현 픽셀을 회색 측정할 수 있도록 설계하는 플러그인을 사용하여 GFP 발현을 확인합니다.
- 평균 출력을 복사는 Microsoft Office Excel로 ImageJ 및 붙여넣기에서 값을 그레이 스케일. 의미를 곱하여 각 채널 (빨간색과 초록색)의 GFP 발현을 계산하면 총 숫자로 픽셀당 가치를 그레이 스케일 GFP - 표현 각 채널에 대해 픽셀. 두 채널에 대한 표현 값의 합계는 GFP의 표현을 제공합니다. 값은 유전자 발현 프로파일을 설명하고 직접적인 비교를하는 데 사용할 수 있습니다. 시간 경과 애니메이션 또한 유전자 발현 프로파일의 독특하고 명확한 시각화를 제공하는 "MOV"또는 "AVI"파일을 사용하여 생성할 수 있습니다.
V. 대표 결과
로봇 이미지 수집과 분석 절차 (그림 1) 여기에 짧은 기간의 유전자 발현에 대한 양적 데이터의 대량의 인수 허용했다. GFP 유전자를 사용하여 공장 모터 특성화 경우,이 방법은 일시적 표현 프로필을 만드는 방법 (그림 2)뿐만 아니라 transiently 및 안정 - 변형 식물 조직 5,6에서 자세한 - 방식의 GFP 발현의 추적 유용하지 않습니다. 수집된 연속 이미지를 생성 짧은 시간 - 저속 애니메이션 플랜트 조직에서 시간이 지남에 따라 유전자 발현에 대한 심층 분석을위한 유용한 도구입니다. 이 방법은 또한 직접적인 유전자 발현에 영향을 미칠 요인을 평가하기위한 훌륭한 응용 프로그램을하고 있습니다. 예를 들어, 바이러스 원산지 입을 다양한 진압의 존재 하에서 GFP 과도 표현이 성공적으로 우리의 자동 이미지 수집 및 분석 시스템 7,8을 사용하여 연구하고 있습니다.
그림 1. 이미지 분석 절차는 네 가지 주요 단계로 구성되어 있습니다. (A) 로봇 이미지 수집 시스템, 빨강, 파랑과 녹색 채널로 이미지 (B) 분리, 임계값 수준을 조정하여 표현하는 픽셀의 (C) 세분화, 및 (D)의 출력 결과를 얻기를 사용하여 이미지 시리즈의 취득 포함하는 가치와 GFP - 표현 초점 카운트를 그레이 스케일.
그림 2. GFP로 융합 식물 발기인에 의해 구동 다른 과도 표현 프로필을 보여주는 그래프. 데이터는 우리의 로봇 이미지 수집 시스템을 사용하여 수집하고 ImageReady와 ImageJ 소프트웨어로 분석했다.
Discussion
로봇의 사용은 인간의 삶의 다양한 측면에서 큰 응용 프로그램을 가지고, 특히, 로봇이 효과적으로 지루하고 복잡한 활동을 자동화하고,보다 정확한 방법으로 작업을 수행하기 위해, 위험한 환경에서 활동을 수행하는 데 사용되었습니다. 분자 생물학, 그리고 특히 유전자 발현 분석에, 로봇은 유전자뿐 아니라 기능뿐만 아니라 시간이 지남에 따라 조직의 성장과 발전을 추적할 수 있습니다. 많은 생물 학적 현상은 단일 시점의 관찰을 사용하여 수행하기 어려울 수있는, 동적으로 발생합니다.
표현 연구 GFP 유전자의 사용은 조직의 반응과 성장을 관찰에 대한 추가 혜택을 제공합니다. 우리의 실험 절차를 보려면, GFP는 우리 GFP 탐지가 아닌 파괴와 같이 시간이 지남에 따라 조직의 동일한 조각의 유전자 발현을 따르 수 있습니다. 또한, GFP 단백질의 우리의 버전 감지를 허용하도록 충분히 안정뿐만 아니라 우리가 상승과 유전자 표현의 가을을 모두 수행하므로 식물 조직의 축적을 최소화하기 위해 일부 매출을 보여줍니다.
우리는 이미 애플 리케이션의 광범위한 로봇 이미지 수집 및 분석 시스템을 활용했습니다. 우리는 현상의 역동적인 이해가 필요한 것입니다 많은 생물 학적 응용 프로그램에 대한 높은 가능성을 예견. 예를 들어, 식물 조직의 성장과 발전은 귀중한 통찰력 / 다음 프로세스에 대한 정보를주는 시스템을 사용하여 추적할 수 있습니다. 또한, GFP 같은 기자 유전자를 사용하여 단백질 수송의 역학은 시간 경과 애니메이션을 사용하여 쉽게 시각하실 수 있습니다. 이 보고서에서 설명하는 방법은 기술적으로 복잡하지만 개념적으로 간단합니다. 우리의 결과는 강력하고 새로운 어플 리케이션이 지속적으로 발견되고있다.
Acknowledgments
급여 및 연구 지원은 미국의 대두위원회에서 제공하고, 오하이오 주립 대학 / 오하이오 농업 연구 개발 센터 appropriated 주 및 연방 기금에 의해 하였다. 이 연구는 부분적으로 CMHG에 CONACYT 멕시코에서 친교에 의해 지원되었다. 상표 또는 독점적 제품의 언급은 OSU / OARDC에 의해 제품의 보증이나 보증을 구성하지 않고도에도 적합 다른 제품의 배제에 승인을 의미하지는 않습니다. 저널 기사 없음 HCS 09-17.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageJ | Software | National Institutes of Health | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
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