Biology

खुली मीडिया में माइक्रोबियल परिवहन अध्ययन करने के लिए सरल Microfluidic सिस्टम: MicroWorld पर खिड़की

Published: May 3, 2010 doi: 10.3791/1741

Dmitry A. Markov^1,2, Philip C. Samson¹, David K. Schaffer¹, Adit Dhummakupt¹, John P. Wikswo^1,2,3,4, Leslie M. Shor^5,6

¹Vanderbilt Institute for Integrative Biosystems Research and Education, Vanderbilt University, ²Department of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, ³Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, ⁴Department of Physics and Astronomy, Vanderbilt University, ⁵Department of Chemical, Materials and Biomolecular Engineering, University of Connecticut, ⁶Center for Environmental Sciences and Engineering, University of Connecticut

Summary

Microfluidic उपकरणों के लिए वास्तविक समय में और उपयुक्त शारीरिक पैमाने पर जटिल प्राकृतिक प्रक्रियाओं कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम एक सरल microfluidic युक्ति है कि उपसतह में जीवाणुओं के विकास को परिवहन के अध्ययन के लिए प्राकृतिक झरझरा मीडिया की प्रमुख विशेषताओं mimics विकसित किया है.

Protocol

मैं Microfluidic डिवाइस निर्माण

एक microfluidic युक्ति बनाने में पहला कदम एक कंप्यूटर सहायता ड्राइंग प्रोग्राम (सीएडी) में डिवाइस के एक दो आयामी लेआउट आकर्षित है. हम AutoCAD का इस्तेमाल किया है, लेकिन अन्य आरेखण प्रोग्राम भी उपलब्ध हैं, जैसे CleWin, या CorelDraw.
अगले कदम के लिए एक photolithographic मुखौटा बनाना है. डिवाइस आयाम पर निर्भर करता है, संकल्प और बजट की आवश्यकता है, इन मास्क क्रोम (सर्वोच्च संकल्प, उच्च लागत), फोटो फिल्म पर बनाई गई है, में निर्मित किया जा सकता है या भी सीधे एक ओवरहेड पारदर्शिता का उपयोग कर एक उच्च संकल्प प्रिंटर पर मुद्रित. यहाँ, हम करोड़ अग्रिम प्रतिकृतियां कार्पोरेशन, उत्तर Andover, एमए द्वारा निर्मित मास्क का इस्तेमाल किया है.
अगले कदम उठाया राहत मोल्ड बनाने के लिए एक सहज epoxy पर मुखौटा से पैटर्न हस्तांतरण है.
1. सबसे पहले, एक सिलिकॉन वफ़र पर नकारात्मक SU8 photoresist की एक परत इच्छित मोटाई घूमती है, और अधिक विलायक भाप बनकर उड़ जाना बेक्ड. Photoresist सूत्रीकरण और स्पिन गति जमा परत की मोटाई को नियंत्रित करते हैं.
2. फिर, मुखौटा के माध्यम से यूवी प्रकाश की एक खुराक पूर्व निर्धारित पैटर्न से अवगत कराया है. सेंकना एक पोस्ट जोखिम पार लिंक photoresist कोटिंग के प्रकाश उजागर क्षेत्रों, उन्हें अघुलनशील प्रतिपादन.
3. अगला है विकास कदम है, जहां unexposed विरोध एक रासायनिक डेवलपर के साथ हटा दिया जाता है, एक सकारात्मक उठाया राहत संरचना एक मास्टर बुलाया जा.
4. एक तिहाई पाक कदम कहा जाता है एक हार्ड सेंकना कदम आगे संरचनाओं ठीक करने के लिए वैकल्पिक है.
PDMS ढलाई
1. हम microfluidic उपकरणों की ¹ प्रतिकृति ढलाई के लिए सिलिकॉन elastomer पाली (डाइमिथाइल siloxane) का उपयोग करें . सबसे पहले, आधार सामग्री इलाज के एजेंट, एक पेट्री डिश के रूप में एक उथले कंटेनर में ढालना पर डालते के साथ वजन एक 10:1 अनुपात में मिश्रित है, और वैक्यूम के अंतर्गत degassed जब तक सभी दृश्यमान बुलबुले गए हैं.
2. uncured PDMS के साथ मास्टर तो कम से कम 4 के लिए है एक सावधानी से लगाया ओवन में 65 पर रखा ° सी के लिए पार से जोड़ने के लिए होते हैं बहुलक का.
3. बाद PDMS जम जाता है, ढाला अनुभाग बाहर पेट्री डिश की कटौती है. छेद समाप्त डिवाइस में microfluidic रिक्त स्थान का उपयोग करने के लिए डिवाइस के शीर्ष के माध्यम से छिद्रित कर रहे हैं.
कांच को अनुलग्नक
1. स्वच्छ PDMS अचल ऑक्सीजन प्लाज्मा करने के लिए जोखिम के कांच साफ करने के लिए बंधुआ है. सबसे पहले, molded और छिद्रित PDMS और एक साफ कांच स्लाइड संबंध सतह रखा जाता है एक प्लाज्मा क्लीनर में. हम एक PDC-32G Harrick प्लाज्मा क्लीनर का इस्तेमाल किया.
2. चैम्बर के बाद बंद कर दिया है, ऑपरेटर एक वैक्यूम पंप पर मुड़ता है और फिर रेडियो आवृत्ति या आरएफ स्रोत है. प्लाज्मा स्वयं कक्ष में आग लगना होगा, कक्ष में एक थोड़ा बैंगनी चमक द्वारा evidenced.
3. 30 सेकंड के लिए प्लाज्मा के लिए जोखिम के बाद, आरएफ और फिर वैक्यूम पंप के स्रोत बंद कर दिया है.
4. जल्दी, गिलास स्लाइड और PDMS युक्ति कक्ष से हटा रहे हैं और सीधे संपर्क (ढाला PDMS सतह नीचे की ओर) में लाया. यह एक अपरिवर्तनीय बांड फार्म, और भी सतह के गुणों हाइड्रोफिलिक कर देगा.
5. अगर वांछित, अलग सतह chemistries PDMS के साथ प्रोटीन के स्थिरीकरण के माध्यम से किया जा सकता है सोखना या सहसंयोजक संबंध द्वारा सतह पर हासिल की है.
6. डिवाइस तो विआयनीकृत जल, विकास, मीडिया, या केशिका बलों या एक सिरिंज के साथ कोमल दबाव के उपयोग के द्वारा कृत्रिम भूजल जैसे तरल पदार्थ के साथ भरा जा सकता है.

द्वितीय. Microfluidic डिवाइस के द्वारा फ्लो मात्रा gravimetric विश्लेषण

दबाव संचालित डिवाइस में प्रवाह जांचना, सूक्ष्म संरचित प्रवाह कोशिकाओं पहले डि पानी के साथ preloaded रहे थे.
एक प्लास्टिक सिरिंज या प्रवाह मॉड्यूल के रूप में एक तरल युक्त जलाशय, (चित्र 1 में दिखाया गया है) अपस्ट्रीम इनलेट जुड़ा हुआ है ठीक है, और जलाशय में द्रव की ऊंचाई बहाव में ऊंचाई से ऊपर अच्छी तरह से बनाए रखा है.
नमूने एकत्र कर रहे हैं बेकार में अच्छी तरह से नियमित अंतराल पर और एक विश्लेषणात्मक संतुलन पर तौला.
कुल समय बनाम कुल मात्रा की साजिश रचने वक्र की ढलान औसत बड़ा प्रवाह की दर (चित्रा 2) देता है. हम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, दबाव सिर की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अलग दबाव बनाए रखने प्रणाली के लिए रेखीय औसत वेग पाया है.

III. फ्लो विज़ुअलाइज़ेशन, वेग, मानचित्रण और हाइड्रोफिलिक / Hydrophobic इंटरेक्शन

मॉडल अंशांकन के लिए, दोनों Carboxy YG और सादा YG सतहों में 3 फ्लोरोसेंट लाटेकस मोतियों सुक्ष्ममापी Polysciences इंक से हासिल किया गया और डि पानी में 0.01% ठोस की एकाग्रता को पतला थे.
निवास के माध्यम से बह मोती Zeiss Axiovert 25 प्रतिदीप्ति Mightex BCE-B013 - यू मोनोक्रोम कैमरा के साथ सुसज्जित खुर्दबीन पर कल्पना थे.
व्यक्तिगत फ्रेम तेजी से उत्तराधिकार में कब्जा कर लिया गया और ImageJ सॉफ्टवेयर पैकेज (चित्रा 3) के साथ फिल्मों में इकट्ठे हुए.

चतुर्थ. बैक्टीरियल ग्रोथ और परिवहन मॉडलिंग के लिए microfluidic डिवाइस (EcoChip)

विब्रियो सपा. GFP कान, एक गैर रोगजनक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त जीव Luria Bertani मध्यम में 14 घंटे के लिए लगभग ¹⁰ 9 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता के लिए हो गया था .
मध्यम विकास में जीवाणु EcoChip उपकरणों में पेश किए गए और डिवाइस उपनिवेश और 19 घंटे के लिए रातोंरात flocs और फिल्मों की स्थापना की अनुमति दी.
फिर विकास मीडिया कुओं से हटा दिया गया था और निवास के सभी कृत्रिम समुद्री जल के साथ प्लावित (वैंग एट अल. ² ASW नुस्खा के लिए देखने के लिए कृपया) इतना है कि बैक्टीरिया के विभिन्न घनत्व के विभिन्न निवास में शेष रहे थे.
एक वास नहीं प्रवाह के साथ सील रखा था, जबकि 3 अन्य निवास में धीमी गति से प्रवाह की स्थिति बनाए रखा गया.
प्रतिदीप्त और बैक्टीरियल वृद्धि के सफेद प्रकाश चित्रों (चित्रा 4) कई दिनों की अवधि के लिए हर 15-20 घंटे ले जाया गया.

वी. प्रतिनिधि परिणाम

प्रवाह मॉड्यूल विनियमन और वितरण एकाधिक निवास के माध्यम से प्रवाह के लिए सरल साधन प्रदान करता है है. Gravimetric विश्लेषण के लिए एक आसान और सीधा वास संरचनाओं, जो निवास और इनपुट और आउटपुट कुओं के बीच दबाव अंतर के हाइड्रोलिक प्रतिरोध पर निर्भर करता है के माध्यम से प्रवाह दरों का निर्धारण साबित. मनका प्रवाह प्रयोगों के लिए हम uncarboxylated मोती (चित्रा 2) के लिए उपकरण सतहों पर बहुत बड़ा मनका संचय मनाया गया है. इसके अतिरिक्त, बड़े व्यास मोती, 6 और 10 मिमी, अधिक छोटे ताकना उद्घाटन में entrained बनने के लिए और डिवाइस में जमा करने के लिए शुरू की संभावना थे. तेजी से प्रवाह दरों कण प्रतिधारण और entrainment कम कर दिया.

बैक्टीरिया विकास के प्रयोगों के दौरान, प्रवाह की स्थिति के प्रभाव स्पष्ट रूप से स्पष्ट है. सतत कर्तन बलों कुल के लिए एक साथ बैक्टीरिया और फार्म flocs कारण है, और व्यक्ति की कोशिकाओं के रूप में नहीं पाया जा. बड़े बैक्टीरियल flocs के परिवहन के एक महत्वपूर्ण पर्यावरणीय प्रक्रिया है जो अत्यंत कठिन एक macroscopic प्रणाली में अध्ययन है.

चित्रा 1 योजनाबद्ध दिखा सुविधाओं और प्रवाह मॉड्यूल के आपरेशन..

चित्रा 2. संरचित वास के माध्यम से प्रवाह की दर के रूप में अलग स्तंभ हाइट्स के लिए gravimetric विश्लेषण द्वारा निर्धारित है. स्तंभ ऊंचाई अनुपात: 60 / 40 = 1.5, निर्धारित प्रवाह दर अनुपात: / 0.71 1.04 = 1.46. एच = 40 मिमी के लिए प्रवाह दरों के परिणामस्वरूप है वी = 0.71 μL / मिनट और एच के लिए = 60 मिमी है वी = 1.04 μ एल / मिनट. अनुमानित औसत रेखीय वेग 3.1 मिमी / और 4.6 मिमी / एस क्रमशः रहे हैं.

चित्रा 3. 3um लाटेकस मोतियों के साथ और संरचित निवास के माध्यम से बह carboxylation के बिना परिवहन.

चित्रा 4 बैक्टीरियल वृद्धि और एक धीमी गति से प्रवाह की उपस्थिति में बीज घनत्व के एक समारोह के रूप में biofilm गठन में परिवर्तन.

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Discussion

EcoChip प्रणाली एक व्यक्ति के प्रयोग की जरूरतों के लिए अनुकूलनीय है. नए स्वामी अपेक्षाकृत आसानी से बनाया जा सकता है, और एक बार एक मास्टर गढ़े है, बिल्कुल दोहराया अतिरिक्त उपकरणों जरूरत के रूप में डाली जा सकता है. प्रवाह मॉड्यूल का उपयोग करने के लिए सरल है, कोई विशेष उपकरणों या जटिल कनेक्शन की आवश्यकता है, और एक साधारण गिरने सिर दबाव संचालित प्रवाह प्रणाली के रूप में modeled किया जा सकता है. इस काम के लिए अतिरिक्त एक्सटेंशन चल रहे हैं, और humic एसिड लेपित चैनल बनाने, और व्यवस्थित बह द्रव की जलीय रसायन शास्त्र अलग शामिल हैं. इस दृष्टिकोण का प्रयोग, सतहों और छिद्रपूर्ण मीडिया में विकास और परिवहन घटना के साथ सूक्ष्म पैमाने पर बैक्टीरिया की बातचीत सीधे मनाया जा सकता है और व्यवस्थित जांच.

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Acknowledgments

इस अध्ययन के अनुदान # 0649883 द्वारा एकीकृत Biosystems अनुसंधान और शिक्षा (VIIBRE) के लिए Vanderbilt संस्थान द्वारा राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन, और Searle सिस्टम्स बायोलॉजी और बायोइन्जिनियरिंग अंडर ग्रेजुएट रिसर्च अनुभव (Searle SyBBURE) द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning
SU8-2025	MicroChem Corp.
Fluorescent Beads	Polysciences, Inc.

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References

Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
Wang, W., Shor, L. M., LeBoeuf, E. J., Wikswo, J. P., Kosson, D. S. Mobility of protozoa through narrow channels. Applied and Environmental Microbiology. 71, 4628-4637 (2005).