Gözenekli Ortam Mikrobiyal Ulaştırma incelenmesi için basit mikroakışkan Sistemleri: Mikrodünya Pencere

Summary

Mikroakışkan cihazlar gerçek zamanlı olarak ve uygun fiziksel ölçeklerde karmaşık doğal süreçler görselleştirmek için kullanılabilir. Biz yeraltı bakteri büyüme ve taşımacılık eğitimi için doğal gözenekli ortamın temel özellikleri taklit basit bir mikroakışkan cihaz geliştirdik.

Abstract

Gözenekli ortam Mikrobiyal büyüme ve ulaşım, yeraltı ve yüzey suyu, geri dönüşüm, çevre besin yanı sıra doğrudan içme suyu temini patojenlerin iletim kalitesi için önemli etkileri var. Doğal gözenekli ortam karmaşık bir fiziksel topolojisi, çeşitli yüzey kimyaları, besin ve elektron alıcıları dinamik gradyanlar ve mikropların bir yamalı dağılımı oluşur. Bu özellikler, mikron uzunluk ölçeği üzerinde yorumlamak zor mikrobiyal taşıma makro ölçekli araştırmaların sonuçları önemli ölçüde değişiklik gösterir ve mekanistik modelleri doğrulama zorlu. Burada basit mikroakışkan cihazları, mikro-yapılandırılmış habitatlar mikrobiyal etkileşimler görselleştirmek için gözlenen olayların etkileyen temel süreçleri tanımlamak için, sistematik öngörü modelleri doğrulamak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Basit, kullanımı kolay akış hücreleri şeffaf, biyouyumlu ve oksijen geçirgen malzeme poli (dimetil siloksan) inşa edildi. Fotolitografi, standart yöntemler, mikro-yapılandırılmış ustaları yapmak için kullanılan ve çoğaltma kalıp ustaları mikro-yapılandırılmış akış hücreleri atmak için kullanılır. Akış hücresi odasının fiziksel tasarım deneysel gereksinimlerine uyarlanabilir: basit doğrusal bağlantılar karmaşık mikro değişebilir 2 mm gibi küçük bir özelliği boyutları ile topolojileri. Modüler EcoChip akış hücresi dizi odaklı bir ağırlık akış modülü ile aynı odaları ve akış kontrolü onlarca sahiptir. Biz yüzey kimyası, akışkan özellikleri veya mikrobiyal nüfusun özelliklerine etkisi incelenmiştir EcoChip cihazların kullanımı yoluyla, fiziksel yapıları ve basınç kafaları sabit tutulur ya da sistematik farklılık olabilir göstermektedir. Patojen olmayan kullanarak taşıma deneyler sayesinde, yeşil floresan protein eksprese

Protocol

I. mikroakışkan Aygıt Fabrikasyon

1. Mikroakışkan bir aygıtı oluştururken ilk adım, bilgisayar destekli çizim (CAD) programı cihazın iki boyutlu bir düzen çekmektir. Biz AutoCAD kullanmış, ancak diğer çizim programları gibi CleWin olarak da kullanılabilir, ya da CorelDraw.
2. Bir sonraki adım, bir fotolitografik maske imal etmek. Cihaz boyutlarına bağlı olarak, çözünürlük ve bütçe gerekli, bu maskeleri fotoğraf filmi oluşturulan krom (yüksek çözünürlük, yüksek maliyet), fabrikasyon ya da yüksek çözünürlüklü bir yazıcı kullanarak bir tepegöz şeffaflık doğrudan baskılı olabilir. Burada, Cr Advance Reprodüksyonlar Corp, North Andover, MA tarafından üretilen maske kullanılmalıdır.
3. Bir sonraki adım, yükseltilmiş bir rahatlama kalıp oluşturmak için ışığa epoksi üzerine maske desen transfer etmektir.
   1. İlk olarak, negatif SU8 fotorezist bir katman istenilen kalınlıkta bir silikon yonga üzerine döndü ve aşırı solvent gaz haline pişmiş. Rezist formülasyonu ve dönüş hızları yatırılan tabakasının kalınlığını kontrol eder.
   2. Sonra, desen, maske aracılığıyla UV ışık önceden belirlenmiş bir doz maruz kalmaktadır. Yazılan maruz fırında çapraz bağlantıları onları çözünmez hale fotorezist kaplama ışığa maruz kalan bölgeler.
   3. Sonraki Pozlanmamış karşı geliştirme adım, olumlu bir kaldırdı kabartma yapısı, bir ana olarak adlandırılan bırakarak, kimyasal bir geliştirici ile kaldırılır.
   4. Üçüncü bir pişirme adımı olarak adlandırılan sabit bir fırında adım daha yapılarını düzeltmek için isteğe bağlıdır.
4. PDMS kalıplama
   1. Biz mikroakışkan cihazlar ¹ çoğaltma kalıplama için silikon elastomer poli (dimetil siloksan) kullanın. İlk olarak, temel malzeme, böyle bir petri gibi sığ bir kap içinde kalıp üzerine dökülür kür ajan, bir 10:1 ağırlık oranı, karma ve görünür kabarcıklar gitmiş kadar vakum altında gazlar.
   2. Sertleşmemiş PDMS ile usta 65 yaşında en az 4 saat sonra dikkatli bir şekilde tesviye fırın yerleştirilir ° C çapraz bağlama meydana polimer.
   3. PDMS katılaşmış sonra, kalıp bölümü petri kesilir. Delik bitmiş cihaz mikroakışkan alanlarda erişmek için cihazın üst üzerinden yumrukladı.
5. Cam ekli
   1. Temiz PDMS geri dönüşümsüz oksijen plazma maruz camını temizlemek için yapıştırılır. Birincisi, bir plazma temizleyici, kalıp ve delikli PDMS ve temiz bir cam slayt yapışma yüzeyine yerleştirilir. Biz PDC-32G harrick plazma temizleyici kullandı.
   2. Odanın kapatıldıktan sonra, operatör, radyo frekansı veya rf kaynak daha sonra bir vakum pompası döner ve. Plazma odasında biraz mor bir ışık ile kendi kendini gösterdiği gibi, odasında tutuşturmak olacak.
   3. 30 saniye boyunca plazma maruz kaldıktan sonra, rf kaynak ve ardından vakum pompası kapatılır.
   4. Çabuk, cam slayt ve PDMS cihazı odasından çıkarılır ve doğrudan temas (aşağı kalıp PDMS yüzey yan) getirdi. Bu geri dönüşü olmayan bir bağ oluşturur ve yüzey özellikleri de hidrofilik yapacak.
   5. İstenirse, farklı yüzey kimyaları adsorpsiyon veya kovalent bağlanma yüzeyi proteinlerin immobilizasyon ile PDMS ile elde edilebilir.
   6. Cihaz sonra deiyonize su, büyüme ortamı, ya da kılcal kuvvetler veya bir şırınga ile hafif basınç kullanımı suni yeraltı suyu gibi sıvı ile dolu olabilir.

II. Gravimetrik Analiz mikroakışkan Aygıt Akış Niceleme

1. Cihaz basınç tahrikli akış kalibre etmek için, mikro-yapılandırılmış akış hücreleri ilk DI su ile önceden yüklenmiş.
2. Gibi plastik bir şırınga ya da akış modülü gibi bir sıvı içeren rezervuar (Şekil 1'de gösterildiği gibi) memba girişine bağlı olduğu ve rezervuar sıvı yüksekliği de downstream yüksekliği üzerinde tutulur.
3. Örnekler düzenli aralıklarla atık toplanan analitik bir denge tartılır.
4. Toplam hacmi toplam süre vs komplo eğrinin eğimi ortalama hacimsel akış oranı verir (Şekil 2). Biz geniş bir yelpazede baskı başkanları ve farklı basınç sistemleri korumak için tekrarlanabilir, doğrusal ortalama hızları bulduk.

III. Akış Görselleştirme, Hız Haritalama ve Hidrofobik / Hidrofilik Etkileşim

1. Model kalibrasyonu için, hem Karboksi YG ve Düz YG yüzeylerde 3 mikron floresan lateks boncuk Polysciences, Inc satın alındı ​​ve% 0.01 katı konsantrasyonu DI suyla seyreltilmiş.
2. Habitatların akan Boncuk Mightex M.Ö.-B013-U monokrom kamera ile donatılmış bir Zeiss Axiovert 25 floresan mikroskop görüntülenmiştir.
3. Bireysel çerçeveler peş peşe yakalanan ve ImageJ yazılım paketi (Şekil 3) ile filmlerin içerisine monte edildi.

IV. Bakteriyel Büyüme ve Transport Modelleme mikroakışkan Cihazı (EcoChip)

1. Vibrio sp. GFP Kan, patojen olmayan yeşil flüoresan protein ifade organizma yaklaşık 10 ⁹ hücre / ml 'lik bir konsantrasyon Luria-Bertani ortamda 14 saat süreyle yetişmiştir.
2. Besi bakteriler EcoChip cihazların içine giriliyor ve cihaz, 19 saat gece flocs ve filmler kolonize ve kurmak için izin verildi.
3. Sonra büyüme medya kuyulardan çıkarıldı ve tüm yaşam alanlarını, bakterilerin farklı yoğunlukları farklı habitatları kalan olduğunu (Wang ve ^ark. 2 ASW tarifi için bakınız), yapay deniz suyu ile yıka.
4. Yavaş akış koşulları diğer 3 habitatlarda tutuldu Bir habitat, akış ile kapalı tutuldu.
5. Floresan bakteriyel büyüme ve beyaz ışık resimler birkaç gün (Şekil 4) bir süre için her 15-20 saat alınmıştır.

V. Temsilcisi Sonuçlar

Akış modülü birden fazla habitatlar akar düzenleyen ve dağıtılması için basit bir araç sağlar. Gravimetrik analiz, habitat ve giriş ve çıkışı kuyu arasındaki basınç farkları hidrolik direnç bağlıdır habitat yapıları yoluyla akış oranlarını belirlemek için kolay ve basit bir yolu olduğunu kanıtladı. Boncuk akış deneyleri için uncarboxylated boncuk (Şekil 2) için cihaz yüzeylerinde çok daha büyük boncuk birikimi gözlemledik. Ayrıca, büyük çaplı bir boncuk, 6 ve 10 mm, çok daha küçük gözenek açıklıkları sürüklenmemiş olmak ve cihazın birikmesine başlamak için muhtemeldir. Hızlı akış hızı, partikül tutma ve sürüklenmesini azalttı.

Bakteri üremesine deneyleri sırasında, akış koşullarının etkisi açıkça bellidir. Sürekli kesme kuvvetleri birlikte toplam bakteri ve form flocs neden olmaz ve tek tek hücreler bulunabilir. Büyük bakteriyel flocs Ulaştırma, makroskopik bir sistemde çalışmak için son derece zor bir önemli çevresel süreçtir.

Şekil 1'de şematik olarak gösteren özellikleri ve akış modülü operasyon.

Şekil 2 farklı sütun yükseklikleri için gravimetrik analizi ile belirlenen yapılandırılmış yaşam ile Debi. Kolon yüksekliği oranı: 60 / 40 = 1.5, belirlenen akış hızı oranı: 1.04 / 0.71 = 1.46. H = 40 mm sonuçlandı akış hızları V = 0.71 mcL / dak ve, H = 60 mm V = 1.04 μ L / dk. Tahmini ortalama doğrusal hızları sırasıyla 3.1 mm / s ve 4.6 mm / sn.

Şekil 3 ve karboksilasyon yapılandırılmış habitatlar akan 3um lateks boncuk taşınması.

Şekil 4, bakteriyel büyüme ve yavaş bir akış varlığı tohum yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak biyofilm oluşumu değişim .

Discussion

EcoChip sistemi bireyin deney ihtiyaçlarına göre uyarlanabilir. Yeni ustaların görece kolay bir şekilde hazırlandı ve bir ana fabrikasyon bir kez gerektiği gibi tam olarak çoğaltılmış ek cihazlar dökülebilir. Akış modülü, kullanımı kolay, hiçbir özel ekipman veya karmaşık bağlantıları gerektirir ve basit bir düşme kafa basınç tahrikli akış sistemi örnek alınabilir. Bu iş için ek uzantıları devam etmektedir ve hümik asit kaplı kanallar oluşturma ve sistematik akan sıvı sulu kimya değişen içerir. Bu yaklaşımı kullanarak, bakteri gözenekli ortam yüzeyleri ve büyüme ve taşınım olayları ile mikro ölçekli etkileşimleri doğrudan gözlenemeyen ve sistematik biçimde araştırılmalı olabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning
SU8-2025	MicroChem Corp.
Fluorescent Beads	Polysciences, Inc.