Venster op een Microworld: Eenvoudig Microfluïdische Systemen voor het bestuderen van microbiële transport in poreuze media

Summary

Microfluïdische apparaten kunnen worden gebruikt om complexe natuurlijke processen in real-time en op het juiste fysieke schalen te visualiseren. We hebben een eenvoudige microfluïdische apparaat dat de belangrijkste functies van de natuurlijke poreuze media nabootst voor het bestuderen van de groei en het transport van bacteriën in de ondergrond.

Abstract

Microbiële groei en transport in poreuze media belangrijke gevolgen hebben voor de kwaliteit van het grond-en oppervlaktewater, de recycling van voedingsstoffen in het milieu, maar ook direct voor de overdracht van ziekteverwekkers voor de drinkwatervoorziening. Natuurlijke poreuze media is samengesteld uit een ingewikkelde fysieke topologie, gevarieerd oppervlakchemie, dynamische gradiënten van voedingsstoffen en elektronen acceptoren, en een onregelmatige verdeling van de microben. Deze functies variëren sterk over een lengte schaal van micron, waardoor de resultaten van de macro-schaal onderzoek van microbiële vervoer moeilijk te interpreteren, en de validatie van mechanistische modellen uitdagend. Hier laten we zien hoe eenvoudig microfluïdische apparaten kunnen worden gebruikt om microbiële interacties met micro-gestructureerde habitats te visualiseren, om de belangrijkste processen die de waargenomen verschijnselen te identificeren en systematisch te valideren voorspellende modellen. Eenvoudig, gemakkelijk te gebruiken stroom cellen werden opgebouwd uit de transparante, biocompatibel en zuurstof-doorlatend materiaal poly (dimethyl siloxaan). Standaard methoden van fotolithografie werden gebruikt om micro-gestructureerde meesters te maken, en replica gieten werd gebruikt om micro-gestructureerde doorstroming cellen cast van de meesters. Het fysieke ontwerp van de stroom cel kamer is aangepast aan de experimentele eisen: microkanalen kan variëren van eenvoudige lineaire verbindingen naar complexe topologieën met functie maten zo klein als twee micrometer. Onze modulaire EcoChip flow cell reeks kenmerken tientallen identieke kamers en flow control door een zwaartekracht-stroming module. Tonen we aan dat door het gebruik van EcoChip apparaten, fysieke structuren en de druk koppen kunnen worden constant gehouden of systematisch gevarieerd, terwijl de invloed van chemie aan oppervlakken, vloeistof eigenschappen of de kenmerken van de microbiële populatie is onderzocht. Door middel van vervoer experimenten met behulp van een niet-pathogene, groen fluorescerend eiwit tot expressie brengen

Protocol

I. Microfluïdische Device Fabrication

1. De eerste stap in het creëren van een microfluïdische apparaat is om een ​​tweedimensionale lay-out van het apparaat in een computer ondersteunde tekening (CAD)-programma. We hebben gebruik gemaakt van AutoCAD, maar ook andere tekenprogramma's zijn ook beschikbaar, zoals CleWin, of CorelDraw.
2. De volgende stap is het vervaardigen van een fotolithografische masker. Afhankelijk van het apparaat afmetingen, benodigde resolutie en budget, kunnen deze maskers worden vervaardigd in chroom (hoogste resolutie, hoge kosten), opgericht op fotografische film, of zelfs rechtstreeks afgedrukt op een overhead transparantie met behulp van een hoge resolutie printer. Hier hebben we gebruik gemaakt Cr maskers vervaardigd door Advance Reproducties Corp, North Andover, MA.
3. De volgende stap is om het patroon van het masker overbrengen op een lichtgevoelige epoxy op een verhoogde schimmel-reliëf te creëren.
   1. Eerst wordt een laag van negatieve SU8 fotolak gesponnen op een siliconen wafer tot de gewenste dikte, en gebakken tot overmaat oplosmiddel vervluchtigen. Fotolak formulering en centrifugetoerental de controle van de dikte van de afgezette laag.
   2. Vervolgens wordt het patroon blootgesteld aan een vooraf bepaalde dosis UV-licht door het masker. Een na blootstelling aan het bakken cross-links het licht blootgestelde delen van de fotolak coating, waardoor ze onoplosbaar.
   3. Volgende stap is de ontwikkeling, waar de niet-belichte weerstaan ​​wordt verwijderd met een chemische ontwikkelaar, waardoor er een positieve verhoogde-reliëf structuur, een meester.
   4. Een derde stap het bakken van een zogenaamde harde bakken stap is optioneel verder te herstellen van de structuren.
4. PDMS molding
   1. We maken gebruik van de silicone-elastomeer poly (dimethyl siloxaan) voor de replica gieten van microfluïdische apparaten ^1. Ten eerste is het basismateriaal gemengd in een 10:01 verhouding gewicht met de verharder, uitgegoten over de vorm in een ondiepe bak, zoals een petrischaaltje en ontgast onder vacuüm tot alle zichtbare luchtbellen zijn verdwenen.
   2. De kapitein de uitgeharde PDMS wordt dan geplaatst in een zorgvuldig geëgaliseerd oven gedurende minstens 4 uur bij 65 ° C voor de verknoping van het polymeer optreedt.
   3. Na het PDMS is gestold, wordt het gevormde gedeelte uitgesneden van de petrischaal. Gaten worden geponst door de bovenkant van het apparaat om de microfluïdische ruimtes in het uiteindelijke apparaat te openen.
5. Gehechtheid aan glas
   1. Schoon PDMS is onomkeerbaar gebonden aan glas te reinigen door blootstelling aan zuurstof plasma. Eerst worden de gegoten en sloeg PDMS en een schoon glasplaatje geplaatst verlijmen oppervlak tot in een plasma schoner. We gebruikten een PDC-32G Harrick plasma schoner.
   2. Nadat de kamer wordt gesloten, de exploitant draait op een vacuümpomp en dan de radio-frequentie of rf bron. Plasma zal zelf ontbranden in de kamer, blijkt uit een licht paarse gloed in de kamer.
   3. Na blootstelling aan plasma gedurende 30 seconden, zijn de RF-bron en vervolgens de vacuümpomp uitgeschakeld.
   4. Snel worden de glazen schuif-en PDMS het apparaat verwijderd uit de kamer en in direct contact gebracht (PDMS gevormde oppervlakte naar beneden). Dit zal een onomkeerbare band, en zal ook de oppervlakte-eigenschappen hydrofiel.
   5. Indien gewenst, kunnen verschillende oppervlakchemie worden bereikt met PDMS door immobilisatie van eiwitten op het oppervlak door adsorptie of covalente binding.
   6. Het apparaat kan vervolgens worden gevuld met vocht, zoals gedemineraliseerd water, groei media, of kunstmatig grondwater door capillaire krachten of het gebruik van lichte druk met een spuit.

II. Stroom Kwantificering van Microfluïdische Device door Gravimetrische Analyse

1. Te kalibreren drukgedreven stroom in het apparaat, zijn micro-gestructureerde stroom cellen eerst geladen met DI-water.
2. Een vloeistof met een reservoir, zoals een plastic spuit of de flow module (zie Figuur 1) is aangesloten op de upstream inlaat goed, en de hoogte van de vloeistof in het reservoir blijft boven de hoogte van de stroomafwaartse goed.
3. Monsters worden verzameld bij het afval goed op regelmatige tijdstippen en gewogen op een analytische balans.
4. De helling van de curve plotten totale volume ten opzichte van de totale tijd geeft de gemiddelde volumestroom (figuur 2). Wij hebben gevonden reproduceerbaar, lineaire gemiddelde snelheden voor een breed scala van druk hoofden en voor verschillende druk-onderhouden van systemen.

III. Flow Visualisatie, Velocity Mapping, en hydrofiele / hydrofobe interactie

1. Voor model kalibratie, werden drie micrometer fluorescerende latex bolletjes in zowel Carboxy YG en Plain YG oppervlakken verkregen van Polysciences, Inc en werden verdund in DI water om de concentratie van 0,01% vaste stoffen.
2. Kralen die door de habitats werden gevisualiseerd op een Zeiss Axiovert 25 fluorescentiemicroscoop uitgerust met een Mightex BCE-B013-U zwart-wit camera.
3. Individuele frames werden gevangen in snelle opeenvolging en geassembleerd in films met de ImageJ softwarepakket (figuur 3).

IV. Microfluïdische Device (EcoChip) voor het modelleren van bacteriële groei en Vervoer

1. Vibrio sp. GFP Kan, een niet-pathogene groen fluorescerend eiwit tot expressie organisme is gekweekt voor 14 uur in Luria-Bertani medium tot een concentratie van ongeveer 10 ⁹ cellen / ml.
2. Bacteriën in het groeimedium werden geïntroduceerd in EcoChip apparaten en mag het apparaat koloniseren en vlokken en films 's nachts voor 19 uur vast te stellen.
3. Dan is de groei van media werd verwijderd uit de putten en alle van de habitats werden gespoeld met kunstmatig zeewater (zie Wang et al.. ² voor ASW recept), zodat verschillende dichtheden van bacteriën waren die nog in verschillende habitats.
4. Een leefgebied werd gehouden afgesloten met geen doorstroming, terwijl de langzame stroom omstandigheden werden gehandhaafd in de 3 andere habitats.
5. Fluorescerende en wit licht foto's van de bacteriële groei werden genomen om de 15-20 uur voor een periode van meerdere dagen (figuur 4).

V. representatieve resultaten

De stroom module biedt eenvoudige middelen voor het regelen en verspreiden stroomt door verschillende habitats. Gravimetrische analyse bleek een gemakkelijke en eenvoudige manier om de stroomsnelheid te bepalen door de habitat structuren, die afhankelijk zijn van de hydraulische weerstand van de habitats en de drukverschillen tussen input en de output putten. Voor de kraal stroom experimenten die we hebben gezien veel grotere kraal accumulatie op het apparaat oppervlakken voor de uncarboxylated kralen (figuur 2). Bovendien, een grotere diameter kralen, 6 en 10 mm, waren veel meer kans om te worden meegevoerd in de kleinere poriën en openingen te accumuleren in het apparaat te beginnen. Hogere stroomsnelheden minder deeltjes retentie en entrainment.

Tijdens de groei van bacteriën experimenten de invloed van de stroming is duidelijk zichtbaar. Continu schuifkrachten veroorzaken bacteriën te aggregeren samen en vormen vlokken, en niet te vinden als individuele cellen. Vervoer van grote bacteriële vlokken is een belangrijke milieu-proces dat is uiterst moeilijk om te studeren in een macroscopisch systeem.

Figuur 1. Schematische weergave kenmerken en werking van flow module.

Figuur 2. Debiet door de gestructureerde leefomgeving, zoals bepaald door gravimetrische analyse voor de verschillende kolommen hoogtes. Column hoogteverhouding: 60 / 40 = 1,5, bepaald debiet ratio: 1,04 / 0,71 = 1,46. Resulteerde debieten voor H = 40 mm is V = 0,71 pL / min en voor H = 60 mm is V = 1,04 μ L / min. Geschatte gemiddelde lineaire snelheden zijn 3,1 mm / s en 4,6 mm / s resp.

Figuur 3. Transport van 3um latex kralen met en zonder carboxylering die door de gestructureerde habitats.

Figuur 4. Verandering in de groei van bacteriën en biofilmvorming als een functie van zaad dichtheid in aanwezigheid van een langzame doorstroming.

Discussion

Het EcoChip systeem is aanpasbaar aan de behoeften van een individu experiment. Nieuwe meesters kan relatief eenvoudig worden aangemaakt, en een keer een meester is vervaardigd, extra exact gekopieerd apparaten kunnen worden gecast als dat nodig is. De stroom module is eenvoudig te gebruiken, vereist geen speciale apparatuur of complexe verbindingen, en kan worden gemodelleerd als een eenvoudige falling head drukgedreven flow systeem. Extra extensies om dit werk te zijn aan de gang, en omvatten het creëren van humuszuur gecoate kanalen, en het systematisch variëren van de waterige chemie van de stromende vloeistof. Met deze aanpak kan de micro-schaal interacties van bacteriën met oppervlakken en de groei en de transportverschijnselen in poreuze media direct worden geobserveerd en systematisch onderzocht.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning
SU8-2025	MicroChem Corp.
Fluorescent Beads	Polysciences, Inc.