חלון על המיקרו: מערכות Microfluidic פשוט לחקר התחבורה מיקרוביאלית בתווך נקבובי

Summary

מכשירים microfluidic יכול לשמש כדי לחזות תהליכים טבעיים מורכבים בזמן אמת על המאזניים פיזי המתאים. פיתחנו מכשיר microfluidic פשוט המחקה התכונות העיקריות של התקשורת נקבובי טבעי ללימוד הצמיחה הובלה של חיידקים מתחת לפני הקרקע.

Abstract

הצמיחה הובלה מיקרוביאלית ו בתווך נקבובי יש השלכות חשובות על איכות מי התהום ועל פני השטח, מיחזור של חומרים מזינים בסביבה, כמו גם ישירות עבור העברת פתוגנים לאספקת מי שתייה. בתווך נקבובי טבעי מורכב טופולוגיה פיזית מורכבת, chemistries משטח מגוונות, הדרגתיים דינמית של חומרים מזינים acceptors האלקטרון, וכן הפצה אחידה של חיידקים. תכונות אלה משתנים באופן משמעותי על היקף באורך של מיקרון, מה שהופך את תוצאות המאקרו היקף החקירות התחבורה חיידקים קשה לפרש, ואת אימות של מודלים מכניסטיים מאתגר. כאן אנו מדגימים כיצד מכשירים microfluidic פשוט יכול לשמש כדי לחזות אינטראקציות עם חיידקים מיקרו מובנה בתי גידול, כדי לזהות תהליכים מרכזיים המשפיעים על התופעות שנצפו, וגם באופן שיטתי לאמת מודלים חזוי. פשוט, קל לשימוש בתאי תזרים נבנו מתוך שקוף, חומר פולי ביולוגית חמצן חדיר (דימתיל siloxane). שיטות האחיד של photolithography שימשו כדי להפוך מיקרו מובנה אדונים, דפוס העתק שימש להטיל מיקרו תאים מובנים לזרום המאסטרים. העיצוב הפיזי של תא תא תזרים ניתנת להתאמה לדרישות הניסוי: microchannels יכול לנוע בין חיבורי ליניארית פשוטה טופולוגיות מורכבות עם בגדלים תכונה קטנים כמו 2 מיקרומטר. תזרים EcoChip מודולרי שלנו מערך תכונות תא עשרות חדרי זהים בקרת זרימה ידי מודול הכבידה מונע זרימה. אנו מראים כי באמצעות השימוש במכשירים EcoChip, מבנים פיזיים וראשי לחץ ניתן לקיים קבוע או מגוון שיטתי תוך השפעת כימיה של פני השטח, תכונות נוזלים, או את המאפיינים של אוכלוסיית חיידקים הוא נחקר. באמצעות ניסויים הובלה באמצעות פתוגניים שאינם, ירוק ניאון חלבון מביע

Protocol

I. Microfluidic ייצור המכשיר

1. הצעד הראשון ביצירת מכשיר microfluidic היא למשוך פריסת two ממדי של המכשיר תוכנית בסיוע מחשב (CAD) הציור. השתמשנו AutoCAD, אבל תוכניות ציור אחרים זמינים אף הם, כמו CleWin, או CorelDraw.
2. השלב הבא הוא לפברק מסכה photolithographic. בהתאם מידות המכשיר, נדרש ברזולוציה תקציב, מסכות אלה יכולים להיות מפוברק כרום (הגבוהה ביותר, ברזולוציה העלות הגבוהה), שנוצר על סרט הצילום, או אפילו להדפיס ישירות על שקיפות עילי באמצעות מדפסת ברזולוציה גבוהה. הנה, יש לנו להשתמש במסכות Cr שיוצרו על ידי רפרודוקציות Advance Corp, צפון Andover, MA.
3. השלב הבא הוא להעביר את התבנית מן המסכה על אפוקסי רגיש כדי ליצור עובש העלה הקלה.
   1. ראשית, שכבת photoresist SU8 שלילי הוא הסתובב על גבי פרוסות סיליקון בעובי הרצוי, לאפות עד לנדוף ממס עודף. ניסוח ספין מהירויות photoresist לשלוט עובי שכבת שהופקדו.
   2. ואז, דפוס נחשף מינון שנקבע מראש של האור האולטרה סגול דרך מסכה. חשיפה הודעה לאפות צולבות הקישורים אור נחשפים אזורים של ציפוי photoresist, טיוח אותם מסיסים.
   3. הצעד הבא הוא פיתוח, שם נחשפו להתנגד יוסר עם מפתח כימיים, ומשאירה חיובי העלה הקלה נקרא אב.
   4. צעד אפייה שלישי בשם צעד קשה לאפות היא אופציונלית נוספת לתקן את המבנים.
4. PDMS דפוס
   1. אנו משתמשים אלסטומר סיליקון פולי (דימתיל siloxane) עבור דפוס העתק של מכשירים microfluidic ^1. ראשית, חומר הבסיס הוא מעורב יחס 10:01 משקל עם הסוכן ריפוי, שפכו מעל התבנית במיכל רדוד כמו בצלחת פטרי, ו degassed תחת ואקום עד שכל הבועות גלויים נעלמו.
   2. האב עם PDMS דפוקה ממוקם אז לפחות 4H בתנור מפולס היטב 65 ° C עבור cross-linking של הפולימר להתרחש.
   3. לאחר PDMS הוא הקרושה, בחלק יצוק נחתך מתוך צלחת פטרי. חורים הם אגרוף דרך החלק העליון של המכשיר כדי לגשת רווחים microfluidic במכשיר המוגמר.
5. קובץ מצורף על זכוכית
   1. נקה PDMS היא ערובה בלתי הפיך לנקות זכוכית כתוצאה מחשיפה פלזמה חמצן. ראשית, PDMS מעוצב באגרופים שקופיות זכוכית נקי ממוקמים משטח מליטה לתוך שואב פלזמה. השתמשנו מנקה PDC-32G Harrick פלזמה.
   2. לאחר תא סגור, המפעיל מדליק משאבת ואקום ואז תדר רדיו או מקור RF. פלזמה תהיה להצית עצמי בחדר, לידי ביטוי בזוהר סגול מעט בחדר.
   3. לאחר החשיפה פלזמה למשך 30 שניות, מקור RF ואז משאבת ואקום כבויים.
   4. במהירות, מחליק את הכוס למכשיר PDMS יוסרו מן החדר והביא במגע ישיר (יצוק בצד PDMS השטח למטה). זה יהיה בצורת אג"ח בלתי הפיך, גם יאפשר את המאפיינים משטח הידרופילי.
   5. אם תרצה, chemistries משטח שונים ניתן להשיג עם PDMS באמצעות קיבוע של חלבונים על פני השטח על ידי ספיחה או מליטה קוולנטיים.
   6. המכשיר אז יכול להיות מלאות בנוזל כגון מים deionized, מדיה צמיחה, או מי תהום מלאכותי על ידי כוחות נימי או להשתמש בלחץ עדין בעזרת מזרק.

השנייה. תזרים כימות המכשיר microfluidic על ידי ניתוח gravimetric

1. כדי לכייל את הלחץ מונע זרימה במכשיר, מיקרו תאים זרימת היו מובנים מראש הראשון עם מים די.
2. מאגר המכיל נוזל, כמו מזרק פלסטיק או המודול זרימה (שמוצג באיור 1) מחוברת כניסת הזרם היטב, את גובה נוזל המאגר נשמר מעל גובה על הזרם היטב.
3. דוגמאות נאספים על הבזבוז היטב במרווחים קבועים ומשקלו על מאזן אנליטית.
4. שיפוע עקום זוממים הנפח הכולל לעומת הזמן הכולל נותן את נפח ממוצע קצב הזרימה (איור 2). מצאנו לשחזור, מהירויות ממוצע ליניארי עבור מגוון רחב של ראשי הלחץ ללחץ-ותחזוקה של מערכות שונות.

ג. ויזואליזציה זרימה, מיפוי מהירות, ו הידרופילי / הידרופובי אינטראקציה

1. לצורך כיול מודל, 3 מיקרומטר חרוזים לטקס פלורסנט הן משטחים Carboxy י.ג. י.ג. ואת מישור נרכשו מ Polysciences, Inc היו מדולל במים DI לריכוז מוצקים 0.01%.
2. חרוזים זורם דרך בתי גידול היו דמיינו על מיקרוסקופ פלואורסצנטי Axiovert 25 Zeiss מצויד במצלמת Mightex לפנה"ס-B013-U מונוכרום.
3. מסגרות בודדים נתפסו ברצף מהיר ו התאספו לתוך סרטים עם חבילת התוכנה ImageJ (איור 3).

IV. המכשיר microfluidic (EcoChip) עבור דוגמנות צמיחה התחבורה חיידקים

1. Vibrio sp. GFP קן, פתוגניים שאינם ירוק לאורגניזם חלבון פלואורסצנטי להביע היה גדל במשך 14 שעות בינוני לוריא-Bertani ריכוז של כ 10 ⁹ תאים / מ"ל.
2. חיידקים במדיום הגידול הוכנסו מכשירים EcoChip ואפשרה ליישב את המכשיר להקים flocs וסרטים לילה במשך 19 שעות.
3. ואז התקשורת צמיחה הוסרה מן הבארות ואת כל בתי הגידול היו סמוקות עם מי ים מלאכותי (ראה וואנג et al. ² למתכון ASW) כך צפיפויות שונות של חיידקים היו שנותרו בבתי גידול שונים.
4. אחת הגידול נשמר אטום עם הזרם לא, בעוד התנאים זרימה איטית נשמרו ב 3 בתי גידול אחרים.
5. תמונות אור פלורסנט לבן של הצמיחה חיידקי נלקחו כל 15-20 שעות לתקופה של מספר ימים (איור 4).

V. תוצאות נציג

המודול מספק זרם באמצעים פשוטים להסדרת והפצה זורם דרך גידול מרובים. Gravimetric ניתוח הוכיח להיות דרך קלה פשוטה כדי לקבוע את שיעורי לזרום דרך המבנים הגידול, אשר תלויים ההתנגדות ההידראולית של בתי הגידול ואת ההבדלים בלחץ בין קלט פלט את הבארות. עבור ניסויים תזרים חרוז ראינו הצטברות חרוז גדול בהרבה על משטחים מכשיר את החרוזים uncarboxylated (איור 2). בנוסף, חרוזים בקוטר גדול יותר, 6 ו - 10 מ"מ, נטו יותר להיות נגרר ב פתחי הנקבוביות קטנות מתחילים לצבור במכשיר. ספיקות מהיר מופחת השמירה החלקיקים entrainment.

במהלך הניסויים גידול חיידקים, השפעת תנאי הזרימה היא בבירור. כוחות הגז רציף לגרום לחיידקים המצטברים יחד flocs צורה, ולא ניתן למצוא גם תאים בודדים. הובלת flocs חיידקי גדול הוא תהליך סביבתי חשוב וזה קשה מאוד ללמוד במערכת מקרוסקופית.

באיור 1. תכונות מראה סכמטי ותפעול של מודול תזרים.

איור 2. ספיקה דרך הגידול מובנים כפי שנקבע על ידי ניתוח gravimetric עבור עמודה לגבהים שונים. גובה טור יחס: 60/40 = 1.5, נקבע שיעור יחס תזרים: 1.04 / 0.71 = 1.46. ספיקות הביא מ"מ עבור H = 40 הוא V = 0.71 μL / דקה עבור H = 60 מ"מ הוא V = 1.04 μ L / min. הערכת מהירויות ליניארי הממוצעת 3.1 מ"מ / s ו - 4.6 מ"מ / s בהתאמה.

איור 3. התחבורה של 3um חרוזים לטקס עם וללא carboxylation זורם דרך בתי הגידול מובנים.

איור 4. שינוי התפתחות חיידקים והיווצרות biofilm כפונקציה של צפיפות הזרע בנוכחות של זרימה איטית.

Discussion

מערכת EcoChip ניתנת להתאמה לצרכים של ניסוי יחיד. אדונים חדשים ניתן ליצור בקלות יחסית, ופעם הראשי הוא מפוברק, מכשירים משוכפל בדיוק נוסף ניתן להטיל לפי הצורך. מודול תזרים הוא פשוט לשימוש, אינה מצריכה ציוד מיוחד או קשרים מורכבים, יכול להיות המודל כראש נופל פשוט לחץ מונחה מערכת הזרימה. סיומות נוספות לעבוד זה מתמשך, כוללים יצירת ערוצי חומצה humic מצופה, ובאופן שיטתי משנים את הכימיה מימית של נוזל זורם. בגישה זו, מיקרו בקנה מידה יחסי הגומלין של חיידקים עם משטחים ותופעות הצמיחה הובלה בתווך נקבובי ניתן לצפות ישירות נחקר באופן שיטתי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning
SU8-2025	MicroChem Corp.
Fluorescent Beads	Polysciences, Inc.